在物理和化学等多种因素的刺激下，细胞内的遗传物质——DNA可能发生多种类型的损伤，如DNA单链或双链断裂、DNA与蛋白质交联、碱基的错配、修饰及脱嘌呤或脱嘧啶位点的形成等。但是，在多种酶的共同作用下，生物体内的DNA 损伤修复系统使损伤的DNA的结构大部分得以恢复，使突变率降低，使得DNA分子的相对稳定性得到保持。如果受损的DNA分子得不到及时有效地修复，细胞很可能走向凋亡(Fousteri and Mullenders, 2008)。当DNA受到紫外线照射时，主要产生环丁烷-嘧啶酮二聚体(CPD)和嘧啶6-4嘧啶酮光产物(6-4PP) (Li et al., 2006)。对于UV照射引起的DNA损伤主要是通过核酸切除修复途径(NER)进行修复的，主要包括泛染色体的核酸切除修复(GG-NER) (Bergink et al., 2006)和转录特异的核酸切除修复(TC-NER) (Sugasawa, 2009)两个途径。

由于染色质高度紧密的结构特点，使得许多DNA活动的调控(如转录和复制等)需要进行染色质改构(chromatin remodeling complex)。前人的研究表明，至少有两类高度保守的染色质修饰复合物与染色质的结构调整有关，即依赖于ATP的染色质改构复合物(Racki and Narlikar, 2008)，利用ATP水解而获得的能量，使DNA与组蛋白之间的相互作用改变；组蛋白修饰酶复合物对组蛋白进行共价修饰(Zhu and Wani, 2010)，即使赖氨酸和精氨酸甲基化、赖氨酸乙酰化、丝氨酸和苏氨酸磷酸化、赖氨酸泛素化、谷氨酸多聚ADP核糖基化和赖氨酸苏素化(Kouzarides, 2007; Wang et al., 2007; Méndez et al., 2010)。依赖于ATP的染色质改构复合物的典型代表是SWI/SNF复合物，人类以 BRG1 或 BRM作为其ATP酶催化亚基(Yoo and Crabtree, 2009)。

最近的研究表明，酵母SWI/SNF复合物与GG-NER中关键的DNA损伤识别因子Rad4-Rad23有着密切的联系(Gong et al., 2006)。在研究NER剪切步骤的结果中发现，人NER蛋白双剪切二核小体的活性可以被ATP依赖的染色质改构复合物增强，从而使核小体被移除并增大了无核小体的DNA连接区域的范围(Hara et al., 2002)。另外，酵母SWI/SNF和相关的ISW2复合物可以增强光修复酶对UV损伤的修复活性(Wolner et al., 2003)，表明了改构复合物在UV照射后的DNA损伤修复中起着重要作用。

BRG1作为人改构复合物的核心催化亚基，在细胞的多种生命活动中具有重要作用，如调控基因的转录、复制、重组、骨骼肌分化及抑制肿瘤发生(Wolner et al., 2003)。但是否参与DNA损伤修复进而挽救细胞凋亡还不是很清楚。本研究建立了UV照射引起DNA损伤的模型。根据这一模型，用30 J/m²剂量的UV照射瞬时转染BRG1表达质粒的SW13 (BRG1-/-) 细胞，在不同的时间点检测细胞的早期凋亡情况。结果表明，转染了BRG1表达质粒的细胞的早期凋亡程度明显较对照组低。我们通过在HeLa细胞中过表达BRG1进一步证实了上述结果，即BRG1可以明显降低由UV照射引起的细胞凋亡。由此，我们推测BRG1可能参与了DNA的损伤修复进而挽救细胞的凋亡。

1结果与分析
1.1 DNA损伤模型的建立
多种因素影响可能导致细胞内DNA分子产生多种类型的损伤。为了研究人染色质改构复合物的核心催化亚基BRG1是否参与DNA损伤修复，我们首先建立了UV照射引起DNA损伤修复的模型。用254 nm波长的紫外线，在样品上方15 cm处照射SW13 (BRG1-/-)细胞，通过调整照射时间来调整照射强度。然后将细胞重新置于CO2培养箱中进行不同时间的损伤修复培养(0 h, 6 h和24 h)，收集样品并用流式细胞术检测细胞早期的凋亡情况。

细胞凋亡的程度随着UV剂量的提高而增强(图1)。在剂量为10 J/m²的UV照射时，照射后0 h和6 h，细胞的早期凋亡率与阴性对照相似，分别为阴性对照的1.28倍和1.29倍；照射后24 h，细胞早期凋亡率为阴性对照的2.27倍，明显提高。在剂量为20 J/m²的UV照射时，分别检测0 h、6 h和24 h后早期凋亡的细胞相对未经UV照射的阴性对照细胞，分别为1.58倍、2.4倍和2.8倍，对细胞造成的损伤程度较10 J/m2 增强，但差别不显著。当UV剂量提高到30 J/m²，分别检测在照射后0 h、6 h和24 h细胞的早期凋亡率，为对照的1.81倍、2.56倍和6.91倍。与10 J/m²和20 J/m²剂量照射结果相比，细胞早期凋亡程度较高，照射24 h后差异最为显著。因此，30 J/m² UV照射时DNA损伤程度较为明显，为最适UV剂量。

图1不同UV剂量对SW13细胞凋亡的影响 Figure 1 The effect of different doses of UV on cell apoptosis in SW13 cells

1.2 SW13 (BRG1-/-)细胞中表达BRG1可以明显降低由UV照射引起的细胞凋亡
为了检测BRG1是否参与调控DNA损伤修复，我们利用BRG1缺陷型的SW13细胞，体瞬时转染BRG1的表达质粒，检测BRG1在该细胞核内的表达情况(图2)。SW13细胞系中无BRG1蛋白的表达，在转染BRG1质粒的细胞中检测到大量BRG1蛋白，确定了BRG1质粒的转染条件。

图2 BRG1在SW13细胞中的表达对细胞凋亡的影响 Figure 2 The effect of BRG1 expressed in SW13 cells on cell apoptosis

我们进一步将BRG1表达质粒瞬时转染到SW13细胞中，用30 J/m²剂量的UV照射，分别在0 h、6 h和24 h检测细胞凋亡。结果表明，对照样品的早期凋亡细胞在不同时间点分别为阴性对照的2.55倍、3.62倍和6.07倍；BRG1表达质粒转染的细胞其凋亡程度分别为阴性对照的1.24倍、1.47倍和3.74倍。BRG1转染细胞的早期凋亡率明显下降，在不同时间点相对凋亡率分别相差1.31倍、2.15倍和2.33倍，24 h时差异最为显著。另外，对照组样品凋亡程度呈明显上升趋势，说明UV照射后对照组走向凋亡的细胞不断增加可能是由于这组细胞修复能力较弱。

1.3过表达BRG1能够明显减少UV照射引起的HeLa细胞凋亡
我们采用了有BRG1表达的人宫颈癌细胞株HeLa验证上述结果。首先在该细胞内脂质体瞬时转染BRG1表达质粒，并检测BRG1在该细胞核内的过表达情况(图3A)，成功转染该质粒的细胞中BRG1蛋白的表达量明显较对照组高。

我们进一步将BRG1表达质粒瞬时转染到HeLa细胞中，用30 J/m²剂量的UV照射，分别在0 h、6 h和24 h检测细胞凋亡。结果表明(图3B)，在经过不同时间修复后，BRG1表达质粒转染的细胞其早期凋亡率都要远低于对照组细胞。结果表明，过表达BRG1的HeLa细胞，其细胞早期凋亡率明显下降，在经过0 h、6 h和24 h的损伤修复培养后，相对凋亡率分别相差2.47倍、3.88倍和5.62倍，且24 h时差异最为显著。上述结果显示，过表达BRG1可能促进了HeLa细胞的DNA损伤修复，降低了细胞凋亡的程度。

图3 BRG1在HeLa细胞中的表达对细胞凋亡的影响 Figure 2 The effect of BRG1 expressed in HeLa cells on cell apoptosis

2讨论
多种物理、化学或自发因素都也能诱导细胞内的DNA分子产生损伤，如果受损DNA没有经过及时有效地修复，细胞将走向凋亡。在DNA损伤修复的过程中，损伤位点可以被多种因子识别，从而使相关修复因子募集到损伤位点上。在这一过程中，染色质改构复合物的参与改变了DNA损伤位点处的染色质结构，促进了损伤位点的识别和相关因子的募集。

通过对核酸切除修复途径的体外研究表明，依赖ATP的染色质改构复合物促进了核酸的剪切(Hara et al., 2002)。研究表明，SWI/SNF复合物可以增强修复因子与染色质的结合。UV照射使限制性酶对染色质的结合及作用增强，而在swi2突变的细胞中这种结合降低了50%，表明SWI/SNF复合物在UV照射引起的DNA损伤修复中扮演了重要的角色(Mazina and Mazin, 2004)。近年，很多研究关注于BRG1对细胞凋亡的影响，例如BRG1通过参与RB-p53通路而调控细胞凋亡(Naidu et al., 2009; Alessio et al., 2010)，或是通过促进细胞周期相关基因的转录为修复损伤DNA争取时间(Gong et al., 2006)。而仅有有限的文献报道BRG1参与到DNA的损伤修复过程，如BRG1通过促进XPC募集到DNA损伤位点进而进行核酸剪切修复(Zhang et al., 2009)，而且观察到BRG1募集到DNA损伤位点上。而BRG1是否直接参与损伤部位的核小体的改构，通过行使其ATPase功能使DNA暴露出来得到修复进而减少细胞凋亡还不是很清楚。

我们的研究发现，在BRG1缺陷的SW13细胞中瞬时转染BRG1表达质粒，可以明显降低由UV照射引起的细胞凋亡，说明BRG1参与了DNA损伤修复的过程；而在BRG1非缺陷的Hela细胞中过表达BRG1，进一步降低了细胞凋亡率，说明过量的BRG1在Hela细胞中提高了细胞修复DNA损伤的效率。说明过表达的BRG1对内源的BRG1的功能有补充作。但是外源BRG1是通过哪种机制促进DNA损伤修复的，我们猜测，BRG1有可能直接参与了损伤DNA所在的染色质结构的松散，提高损伤DNA的修复效率。在接下来的研究中，我们将针对损伤部位核小体松散的程度进行检测，观察BRG1的ATP酶活性对损伤后核小体结构调整的影响。

3材料和方法
3.1材料
人宫颈癌细胞株HeLa和人肾上腺皮质腺癌细胞株SW13购自上海细胞研究所细胞库。

IMDM培养基购自Invitrogen公司；四季青胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；兔源抗BRG1单克隆抗体(SMTRCA4)购自于Santacruz公司；鼠源Tubulin单克隆抗体(AR819)购自Sigma公司；二抗分别为山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG，均为Santacruz公司产品；ECL发光液购自GE Health公司；凯基细胞凋亡检测试剂盒购自南京生物科技发展有限公司。

绿色荧光蛋白质量GFP；BRG1真核表达质粒pBJ5-BRG1和载体质粒pBJ5 (Dr. Keji Zhao, NIH, Maryland惠赠)。

3.2细胞培养
人宫颈癌细胞株HeLa和人肾上腺皮质腺癌细胞株SW13及用含有10% 胎牛血清、青霉素(100 μg/mL)和链霉素(0.01 g/mL)的IMDM培养基于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

3.3脂质体瞬时转染
转染24 h，将0.5~2×10⁵ 细胞接种到 500 L不含抗生素的培养基中，使转染时细胞密度达到 90%~95%。0.8 g DNA 50 L 无血清培养基中。轻混lipofectamine^TM 2000，取2.0 L混入50 L 无血清培养基中，温育5 min。将混合DNA和lipofectamine。作用 20 min后将100 L混合物加入每个含细胞的小室内，轻混。37℃培养，转染4~6 h后可换液，18~48 h后检测。

3.4核蛋白的提取
待细胞丰度达到75%~80%时，用胰酶消化并收集细胞，1000 r/min离心5 min，去上清。将沉淀重悬于PBS中，1500 r/min离心5 min。将沉淀重悬于400 L冰冷的缓冲液A (10 mmol/L Hepes-KOH, pH 7.9, 1.5 mmol/L MgCl₂, 10 mmol/L KCl, 1 mmol/L DTT, PMSF)，置冰上冰浴30 min，NP-40添加至终体积的0.6% (V/V)，剧烈振荡10 s，置冰上冰浴30 min。将沉淀的细胞核重悬于缓冲液B ( 20 mmol/L Hepes-KOH, pH 7.9, 1.5 mmol/L MgCl₂, 400 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L EDTA, 25%甘油, 1 mmol/L DTT, PMSF)，置于4℃摇床剧烈摇动30 s，13 000 r/min离心5 min，核蛋白上清液于-70℃保存。

3.5 Western bloting分析
将样品进行SDS-PAGE，经电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，弃溶液，加入TBST稀释的一抗，室温轻摇1 h；TBST洗3次后，加入5% BSA稀释的二抗，室温轻摇1 h，TBST洗3次后；用ECL显色5 min，压片显影。

3.6流式细胞仪检测凋亡
用胰酶消化并收集细胞。PBS洗涤细胞二次。收集细胞，将5 L AnnexinV-FITC加入到含有500 L Binding Buffer的细胞悬液中混匀，然后加入5 L propidium Iodide混匀，25℃避光5~15 min。反应结束后利用流式细胞仪检测。

作者贡献
通讯作者曾宪录为本研究提供了实验平台及整体的研究框架和思路，并对论文进行了修改和定稿；王晓光进行了实验设计并撰写论文；王蕊进行了流式检测；王玲对本文文字和图片进行了编辑。

致谢
感谢美国Maryland的NIH中心的Keji Zhao先生惠赠BRG1真核表达质粒pBJ5-BRG1和载体质粒pBJ5。本研究由国家自然科学基金(90608021)、吉林省自然科学基金(201112165)和吉林省教育厅科研基金(吉教科合字2012第221号)共同资助。

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