肺癌是最常见的恶性肿瘤，在男性中其发病率和死亡率都已跃居各种恶性肿瘤之首(Jemal et al., 2011)。大量研究表明：镍化合物是经过人类呼吸道的重要致癌物，广泛存在于人类职业环境中。国际癌症研究机构(IARC)早在1987年就将镍及其化合物确认为第一类致癌物(刘林华等, 2010)，但其致癌的分子机制仍不清楚。我们前期研究已证实金属毒物镍的暴露是发生肺癌的重要病因，并建立了结晶型硫化镍(NiS)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)发生恶性转化的动态模型，但具体的致癌机制仍未明了(纪卫东等, 2002; Ji et al., 2008)。

自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，被称为Ⅱ型程序性死亡，是真核细胞特有的生命现象(Edinger and Thompson, 2004)。近年来，随着对自噬研究的不断深入，其在肿瘤中的作用日渐引起广泛关注。有报道称在肺癌临床样本中检测到自噬相关基因Beclin 1表达的下调(Liu et al., 2008)，但由于采取的研究手段有限，自噬途径具体的作用机制还很不清楚。目前文献报道调控哺乳动物自噬主要的信号通路有两大类：第一类为依赖mTOR (mammalian target of rapamycin)激酶途径：mTOR激酶调节细胞生长，可抑制自噬的发生，是自噬的负调控分子(Yang et al., 2005)。mTOR激活后会磷酸化Atg13，使得Atg13/Atg1/Atg7复合体解体，消弱Atg1激酶的活性从而阻止自噬的启动(Maiuri et al., 2007)。第二类为不依赖mTOR激酶途径：酵母Atg6同源蛋白Beclin 1是细胞自噬过程中最重要的正调节因子，通常结合Class ⅢPI3K形成复合体诱导自噬(Kihara et al., 2001)。

为了研究自噬途径在肺上皮细胞癌变中的作用机制，本研究拟利用前期建立的细胞恶性转化模型，主要采用激光共聚焦扫描显微镜成像技术，在无损伤状态下，实时观测活细胞中自噬体标记蛋白GFP-LC3的荧光强度及定位，并利用Western Blotting技术检测细胞内自噬信号通路关键效应分子的表达。以期初步从细胞自噬现象的发生、发展的角度研究肺细胞癌变的分子机制，为肺癌的预防和治疗提供科学依据。

1结果与分析
1.1实时检测自噬在活细胞16HBE-N和16HBE-T中的产生
为了确定自噬途径参与了肺上皮细胞的癌变，可以通过检测正常细胞和恶性转化细胞中自噬体的数目来判断。本研究利用激光共聚焦扫描显微镜在单个活细胞中实时观测LC3蛋白的时空动态变化，发现在GFP-LC3转染24 h的时候，只有少量的荧光细胞，继续培养到48 h后荧光细胞开始增多，通过观测发现16HBE-T细胞中成点状聚集的GFP-LC3的数量比16HBE-N细胞中的数量明显减少，培养至72 h后结果类似(图1)。经过显微镜下随机选择多个细胞进行统计测量，发现16HBE-N细胞的点状聚集个数远远多于16HBE-T细胞(图2)。这个结果证明16HBE细胞恶性转化后自噬水平会明显降低，说明在肺细胞癌变过程中自噬水平会发生改变，因此可以推测自噬是肺细胞癌变的重要机制。

图1 激光共聚焦扫描显微镜下观测正常细胞和恶性转化细胞GFP-LC3的定位 Figure 1 Confocal laser scanning microscopy for the GFP-LC3 location of normal (16HBE-N) and malignant transformedcells (16HBE-T)

图2 细胞中GFP-LC3点状聚集的个数 Figure 2 The number of punctate protein aggregation in the cell

1.2 16HBE-N和16HBE-T细胞中mTOR激酶的磷酸化水平及Beclin 1的表达水平
哺乳动物自噬主要的信号通路有依赖mTOR激酶和不依赖mTOR激酶两大途径。本研究通过检测GFP-LC3的定位情况已经知道16HBE-T细胞的自噬水平比16HBE-N细胞的自噬水平要明显降低，因此下一步希望可以明确自噬水平降低经过的是哪条途径？通过利用Western Blotting技术检测mTOR激酶的磷酸化水平及Beclin 1的表达水平，发现16HBE-T细胞比16HBE-N细胞mTOR激酶的磷酸化水平高，而Beclin 1的表达水平是降低的(图3)，证明恶性转化16HBE细胞过程中两个自噬调控的主要通路均被激活，提示自噬可能通过多条途径参与了肺细胞癌变的过程。

图3  mTOR激酶的磷酸化及Beclin 1的表达水平 Figure 3 The phosphorylation of mTOR kinase and expression level of Beclin 1

2讨论
职业暴露镍化合物人群的暴露途径主要是呼吸道。由于永生化人支气管上皮细胞株16HBE与人支气管上皮细胞的生物学特性基本相似，因此本研究采用的结晶型NiS恶性转化人永生化支气管上皮细胞株16HBE，作为研究肺癌发生模型具有良好的代表性(刘林华等, 2010)。我们前期研究已经建立了结晶型NiS诱导人支气管上皮细胞(16HBE)发生恶性转化的动态模型，利用该模型已经证明肺癌细胞的生物学发生是一个十分复杂的过程，但其具体的致癌机制仍需进一步研究。据目前报道的研究发现，自噬在多种人类肿瘤中均存在活性的改变，且在肿瘤发生、发展的过程中扮演了双重角色，既能抑制肿瘤又能促进肿瘤细胞的生存，因此正确调控自噬途径可能成为预防和治疗肿瘤的新方法(Chen and Karantza, 2011)。Pandit等(2011)最新报道称自噬途径也可能参与了肺细胞的癌变。

为此，本研究利用前期研究建立的结晶型NiS诱导16HBE发生恶性转化的动态模型，首先采用激光共聚焦扫描显微镜成像技术，在无损伤状态下，实时观测活细胞中LC3蛋白的荧光强度及定位，结果发现16HBE细胞恶性转化后自噬水平会明显降低(图1)，几乎只有未转化细胞的1/3水平，充分证明了自噬途径参与了结晶型NiS诱导肺细胞癌变的过程。Western Blotting技术检测mTOR激酶的磷酸化水平及Beclin 1的表达水平，结果发现16HBE-T细胞比16HBE-N细胞mTOR激酶的磷酸化水平高，而Beclin 1的表达水平降低(图2)，证明结晶型NiS 恶性转化16HBE细胞过程中两个自噬调控的主要通路均被激活。

综上说述，我们证明了结晶型NiS可通过依赖mTOR激酶和不依赖mTOR激酶自噬途径参与诱导16HBE细胞恶性转化的癌变过程，这个结果不但可以确定自噬途径在参与癌变过程中的重要性，还说明其复杂性，由于调控这两个途径的上下游信号分子比较多，因此要明确自噬在肺细胞癌变过程中的分子机制从而达到预防和治疗肺癌的目标，需要我们进一步的研究。

3材料与方法
3.1实验材料和仪器
细胞系为结晶型NiS恶性转化细胞16HBE-T。经形态学观察、软琼脂培养及裸鼠成瘤试验证实已经恶性转化；非转化对照细胞16HBE-N，均由本实验室建立(纪卫东等, 2002)。MEM培养基购自GIBCO公司，p-mTOR和Beclin 1抗体购自Cell Signaling Technology公司，β-actin抗体购自santa公司，Lipofectamine^TM 2000 Reagent购自Invitrogen公司，其它所有试剂均为国产分析纯。质粒GFP-LC3惠赠于Professor Marja Jäättelä (Rammer et al., 2010)。

激光共聚焦扫描显微镜(LSM 510/ConfoCor2)及双色红外荧光系统ODYSSEY^® Infrared Imaging System是德国Zeiss公司和美国莱卡公司产品。

3.2细胞培养
16HBE-N和16HBE-T细胞置于含10%小牛血清的MEM培养基中培养，根据实验要求接种不同密度的细胞于培养皿或者培养瓶中，置37℃，5% CO₂的培养箱中培养，每隔48 h换一次液。

3.3细胞转染
取对数生长期的16HBE-N和16HBE-T细胞接种在35 mm直径的特制细胞培养皿内(由本实验室自制)，待细胞达到70%~80%融合时，用Lipofectamine^TM 2000转染试剂按说明将GFP-LC3质粒转染至16HBE-N和16HBE-T细胞，转染4 h后换液，分别于培养24 h、48 h和72 h后置于激光共聚焦扫描显微镜下观察GFP-LC3的表达情况(Yang et al., 2007)。

3.4激光共聚焦扫描显微镜检测
转染后的16HBE-N和16HBE-T细胞均在Zeiss公司LSM 510型激光共聚焦扫描显微镜上采用100倍油镜检测，记录的图像和数据采用Zeiss Rel3.2软件系统进行分析。在本实验中，采用488 nm的氩离子激光作为GFP的激发光源，GFP 的吸收滤色镜选用BP5002550。

3.5 Western Blotting检测
分别收集对数生长期的16HBE-N和16HBE-T细胞，用预冷的PBS清洗两次，采用PMSF裂解液并添加1×protease inhibitor cocktail setⅠ在冰上振荡裂解细胞后，用Bradford法进行蛋白定量。取相同含量的蛋白，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行蛋白分离2 h，电泳后采用100 V恒压1 h将蛋白电转膜至硝酸纤维素膜；印迹膜在含有5%封闭蛋白的TBS-T缓冲液中封闭1 h；在p-mTOR、Beclin 1和β-actin的一抗溶液(抗体用5%封闭蛋白的TBS-T缓冲液1: 1 000稀释)中4℃过夜孵育。次日加入耦联有IRDye800和Alexa Fluor 680的荧光二抗，通过双色红外荧光系统进行mTOR激酶的磷酸化水平及Beclin 1的表达水平检测(张岚和邢达, 2010)。

3.6统计学处理
每种实验至少重复3次，实验数据以mean±SEM表示，采用t检验确定处理组和对照组之间的差异。*P<0.001为显著性差异有统计学意义。

作者贡献
张岚为实验完成人和文章写作人；吕嘉春为实验和文章写作指导人；杨磊协助完成整体实验。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(81102159, 81072366, 30872178)；广东省自然科学基金博士启动项目(S2011040003622)；广东省高层次人才项目(2010-79)、广东高校优秀青年创新人才培养计划项目(2009-7)和广州市科技和信息化局应用基础研究计划项目(12C22021629)共同资助。

参考文献
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