叶绿体是光合作用发生的主要场所。除了进行光合作用外，叶绿体还参与氨基酸、脂肪酸、维生素以及次级代谢产物等许多重要细胞组分的合成(Neuhaus and Emes, 2000)。叶绿体蛋白由叶绿体基因和核基因共同编码完成，其中100多个蛋白是在叶绿体核糖体中合成(Martin et al., 2002)。已有研究表明叶绿体核糖体共有6个特有蛋白，它们由核基因编码，并命名为PSRP，编号1至6 (plastid-specific ribosomal protein1 to 6) (Yamaguchi and Subramanian, 2000)。

PSRP-4蛋白是叶绿体核糖体上的特有蛋白之一。对菠菜叶绿体核糖体蛋白研究表明PSRP-4是30S小亚基里带正电荷最多的蛋白，该蛋白与极端嗜热菌(Thermos thermophilus) 30S亚基核糖体小蛋白具有高度同源性(Leontiadou et al., 2001)。拟南芥中共发现两个Psrp-4同源序列，其中一个与菠菜Psrp-4基因高度同源，命名为Ath-Psrp-4 (Gene bank 登录号为AT2g38140)。Ath-PSRP-4蛋白前体包含50个氨基酸的转运肽，并且具有另外两个特点：即与富含赖氨酸精氨酸Thx蛋白高度同源以及富含脯氨酸疏水结构域。另一个同源基因为假定基因，命名为Ath-Psrp-4h (GenBank 登录号为AT2g2129)，该假基因在拟南芥的EST数据库中尚且没有确定转录本(Yamaguchi and Subramanian, 2003)，Ath-PSRP-4h假定蛋白转运肽更短，推测其可能是线粒体蛋白。然而，关于Ath-PSRP-4蛋白在叶绿体蛋白合成以及光合作用中的作用机制尚无报道。

基因缺失突变体是目前基因功能研究的有效手段之一。其中RNAi技术作为一项快速、高效、便于操作的技术，是创制基因缺失突变体的重要方法(Hannon, 2002)，在植物基因功能的研究得到广泛的应用(Chuang and Meyerowitz, 2000)。

本文通过对Psrp-4基因进行序列分析，利用Gateway系统(Earley et al., 2006)构建该基因的RNAi载体并转化拟南芥，分析了基因对拟南芥光合作用的影响，为进一步探究核糖体的分子调控机制及其在叶绿体蛋白周转中的作用奠定基础。

1结果与分析
1.1  Psrp-4基因分析及克隆
Psrp-4基因在拟南芥中全长为730 bp，含有三个外显子(图1A)。Psrp-4基因序列及其氨基酸序列分析表明，该基因cDNA全长556 bp，其中ORF (the open reading frame)编码一条约为118 个残基的蛋白质。提取野生型拟南芥总RNA，进行1% 琼脂糖凝胶电泳检测得到共3 条带，分别为28S RNA、18S RNA 和5S RNA。其中，28S RNA 与18S RNA 的亮度比例约为2:1，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.9~2.0 之间，表明总RNA 质量较好(图1B)。用本实验设计的引物进行PCR扩增Psrp-4基因RNAi片段，并经电泳检测，得到一条分子量为150 bp左右的条带(图1C)，片段大小与预测相同。 

图1  Psrp-4基因分析及RNAi片段克隆 Figure 1  Psrp-4 gene analysis and clone.

1.2利用Gateway技术构建Psrp-4基因RNAi载体
BP 反应后阳性克隆检测：将克隆得到的Psrp-4基因RNAi片段与Gateway入门载体pGWC-T进行连接反应，转化大肠杆菌(E. coli) DH5α感受态，涂布抗生素平板，随机挑取单克隆并进行菌体PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 产物片段大小与目的基因片段一致(图2A)。将检测所得阳性克隆测序，测序结果经比对与目的序列相同，表明RNAi片段已成功插入到入门载体中，命名为Psrp-4-RNAi-pGWC。利用该质粒进行后续LR反应后，再次转化大肠杆菌(E. coli ) DH5α感受态并涂布抗生素平板。

LR反应后阳性克隆检测：为检测目的RNAi片段是否成功插入到RNAi载体即pJawoh18 载体中，挑取克隆菌液，进行PCR扩增检测。结果表明，PCR 产物片段与目的片段序列大小相同(图2B)。测序正确，命名该表达载体为Psrp-4-pJawoh18。

转化：将Psrp-4-pJawoh18表达载体电击转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101，PCR扩增检测，获得阳性克隆(图2C)。选取阳性克隆测序，表明得到成功转化的农杆菌。

图2  Psrp-4基因RNAi载体构建 Figure 2 Construction of Psrp-4 RNAi vector

1.3转基因植株的获得及表达分析
pJawoh18 载体中携带除草剂抗性标记基因Bar，喷洒Basta后非转基因植株(即野生型拟南芥)枯化死亡，而转基因植株抗除草剂，叶片颜色为绿色，可正常生长(图3A)。通过此方法鉴定并获得5株转基因植株。

为鉴定Psrp-4 基因的表达量，以Actin 基因作为内参基因，对5棵阳性植株进行了半定量PCR。分析结果显示Psrp-4基因在5个转基因拟南芥中都能正常转录表达，但表达量不同程度地低于野生型拟南芥(图3B)，说明在转基因植株中该基因的表达受到了抑制。我们选择Psrp-4基因表达抑制最为强烈的2号转基因植株作为后续的实验材料，并命名为psrp-4突变体。

图3  转基因植株的获得与分析 Figure 3 Obtainment and analysis of transgenic plants

1.4野生型和 psrp-4 突变体植株生长曲线测定
在正常生长条件下，突变体和野生型的幼苗在培养间生长3 周后，psrp-4突变体比野生型植株略小，叶片颜色正常，可进行正常的光合自养(图4A)；在生长过程中突变体植株的叶面积增长速率要比野生型的稍微缓慢，但差别不明显(图4B)，与表型观察结果相同。结果说明，在正常培养条件下，psrp-4突变体可进行正常生长，与野生型拟南芥相比没有明显区别。 

图4   野生型和psrp-4 突变体植株表型及生长曲线 Figure 4 Phenotype and growth rate of WT and psrp-4 mutant plants

 
1.5强光诱导psrp-4突变体的光抑制情况
我们将野生型和psrp-4突变体的离体叶片分别强光胁迫(1 200 μmol m^-2 s^-1)处理1~4 h后，检测其最大光化学效率(Fv/Fm)的变化(图5A)。经过4 h高光处理后，psrp-4突变体的最大光化学效率降低速度及下降幅度与野生型相比均无明显的变化。结果表明，与野生型相比，psrp-4突变体的PSⅡ对光能的利用效率变化不大，光系统的电子传递正常，没有受到损伤。
 
为了进一步检测PSⅡ反应中心D1 蛋白和D2 蛋白含量的变化，我们进而提取经强光处理后的野生型和psrp-4突变体拟南芥叶片的类囊体膜进行蛋白免疫印记分析。结果发现，强光处理条件下，psrp-4 突变体中D1 蛋白和D2 蛋白的变化情况与野生型拟南芥的基本一致(图5B)。 

图5  强光胁迫条件下psrp-4突变体PSⅡ的活性变化及反应中心D1蛋白的降解 Figure 5 PSⅡactivity changes and degradation of D1 protein, the PSII reaction center, under photoinhibition conditions

2讨论
近年来，植物叶绿体研究被越来越多的学者所重视，拟南芥基因组序列分析表明，约1/5的核基因编码的产物定位于叶绿体(Leister, 2003)，大部分功能尚不明确(Friso et al., 2004)。叶绿体核糖体是植物特有的细胞器核糖体，研究证实许多叶绿体核糖体组成蛋白在叶绿体蛋白的合成和光合作用过程中起着重要的作用。玉米PRPS17基因突变后，造成PSⅡ复合物的数量减少，并影响光合电子的传递(Schultes et al., 2000)；在拟南芥中，PRPL11被敲除后，叶片颜色及生长速率发生变化(Pesaresi et al., 2001)，而PRPS21被敲除后，植株光合作用受到抑制(Morita-Yamamuro et al., 2004)。

在拟南芥中，Psrp-4有两个基因拷贝，AT2g38140和AT2g2129、AT2g2129为假基因，在拟南芥的EST数据库中尚且没有确定转录本。因此我们对AT2g38140进行了基因克隆与RNAi载体构建，并进行了光合相关功能研究。

研究结果显示，在正常生长条件下，与野生型相比，psrp-4突变体生长速度有所减慢，但差异并不明显，说明在正常生长条件下Psrp-4基因对拟南芥植株的生长发育的作用并不显著。

光是光合作用所必需的，但若光强过高，会造成光胁迫。光系统Ⅱ(PSⅡ)是执行光诱导电荷分离和电子传递的基本单位，该系统对高光胁迫敏感，因而我们将野生型拟南芥和psrp-4突变体的离体叶片进行高光处理后，测定其最大光化学量子产量(Fv/Fm)。结果显示，相比于野生型拟南芥，psrp-4突变体的光系统没有明显的变化。同时，D1蛋白的快速周转是PSⅡ的重要修复机制(Long et al., 1994)。而D2蛋白的降解速度则远比D1 蛋白低。为了证明PSⅡ蛋白是否发生了变化，我们以D2蛋白作为D1 蛋白降解的参照，进行了蛋白免疫印记实验。实验发现，与野生型拟南芥相比，psrp-4突变体PSⅡ的核心蛋白D1/D2并未发生明显变化，这与上述光化学效率的实验结果是一致的。

以上实验数据说明，在转基因植株中，Psrp-4基因的表达受到了抑制，但其生长发育和光系统特征与野生型相比均无明显变化，说明Psrp-4基因在光系统中并未起到重要的作用。但是由于RNAi并未完全敲除Psrp-4基因，可能较低表达量的Psrp-4基因即可满足植物生长发育的需要，因此需要进一步的实验如定购T-DNA插入突变体等进行验证。这些初步的研究结果，为进一步认识和了解Psrp-4基因在拟南芥中的作用机制创造了条件。

3 材料与方法
3. 1植物材料、菌株和质粒
拟南芥为野生型Col-0 (Arabidopsis thaliana)、pGWC-T 载体、pJawoh18 载体为实验室所有；大肠杆菌(E. coli ) DH5α购自TaKaRa公司，农杆菌GV3101为实验室保存。

3.2试剂与酶
植物总RNA提取试剂盒、DNA快速回收试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自北京天根生化试剂有限公司；PCR试剂、Solution Ⅰ、反转录试剂盒等购自TaKaRa公司；引物合成和测序由华大基因完成。

3.3总RNA提取及cDNA的合成
总RNA 的提取参照RNA prep pure Plant Kit (QIANGEN)说明书进行；cDNA合成按PrimeScriptⅡ1^st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa) 说明合成。

3.4目的基因片段克隆及序列测定
根据NCBI 中公布的拟南芥(Arabidopsis thaliana) Psrp-4基因 (GenBank登录号为AT2G38140)的3´UTR区保守区设计1对特异性PCR引物F：5’-ATGAGATTCTTCACTTGTTGTC-3’；R：5’-AAAGACTCAATGA TTCATAAAGA-3’。利用该对引物，以上述制备好的拟南芥的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸45 s，共29个循环；72℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，切胶回收目的条带并进行纯化，利用紫外分光光度计测定产物浓度。

3.5利用Gateway技术构建Psrp-4基因RNAi载体
BP反应：配制以下连接反应体系: pGWC-T 1 μL (约50 ng)，SolutionⅠ5 μL，Psrp-4基因PCR回收产物3 μL，终体积10 μL。25℃反应4 h。转化大肠杆菌DH5α感受态，并涂布含有Amp 的LB平板，待转化菌落长出后，随机挑取单克隆，进行PCR 鉴定后送往华大基因测序。

提取经测序验证的阳性克隆菌液质粒作为入门载体，进行LR反应。

LR反应：在0.5 mL离心管中配制以下反应体系(总体积5 μL)：入门载体克隆1 μL (30~50 ng)，pJawoh18 vector 1 μL (30~50 ng)，LR Enzyme Mix 1 μL，ddH₂O 2 μL。25℃水浴4 h，转化大肠杆菌DH5α感受态，经菌液PCR 鉴定后测序。提取测序正确的阳性克隆菌液质粒即为重组载体。

3.6农杆菌及拟南芥的遗传转化
将重组载体通过电击法转化农杆菌菌株GV3101，采用花序滴定法转化野生型拟南芥。收取转化后拟南芥种子并充分干燥，置4℃春化48 h后均匀播撒于培养土中，7 d后待幼苗子叶完全张开时喷洒浓度为0.1%的Basta溶液进行转基因植株筛选。

3.7半定量PCR (Semi-quantitation RT-PCR)分析
通过半定量RT-PCR 法对转基因拟南芥Psrp-4 基因的表达量进行分析，采用相关试剂盒进行野生型拟南芥和转基因植株叶片的总RNA提取与cDNA合成。根据目的基因设计特异引物P4rtF：5'-CTCAGCCCAA CTAAACCAT-3'；P4rtR：5'-CACCTATCAGG CACACCTT-3'。以肌动蛋白基因Actin5为内参照基因，引物序列为AcF：5'-TCTTCTTCCGCTCTTTCTTTCC-3'；AcR：5'-TCTTACAATTTCCC GCTCTGC-3'。RT-PCR 扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，28 个循环；72℃ 10 min。根据电泳检测的结果调整模板浓度，直至各样品的Actin5基因的扩增条带亮度一致，然后利用Psrp-4引物扩增调整过的模板32个循环，进行电泳检测基因表达量。

3.8生长曲线测定
分别选取10 株突变体和野生型拟南芥植株，从长出两片真叶时开始测定，测定生长在同一位置的2片叶，将叶片固定在滤纸上并用铅笔描出轮廓，按轮廓剪下滤纸片后称重并与单位面积重量换算得出叶面积。计算公式：叶面积=(剪下滤纸片的重量×单位面积)/单位面积重量。并以叶面积为纵坐标，测定时间点为横坐标，绘制植株生长曲线图。

3.9高光胁迫实验
取温室中培养5周的转基因植株与野生型植株完全展开的叶片，将离体叶片叶面向上浸于水中，室温条件下，用强度为1 200 μmolm^-2s^-1光照处理相应时间。利用荧光测定仪PAM-2000 测定相关指标。测定后，立即将叶片投入液氮速冻后置-80℃冻存，直至后续实验使用。

3.10蛋白免疫印记分析
分别提取转基因植株与野生型拟南芥的类囊体膜，采用Laemmli (1970)系统进行SDS-PAGE电泳，通过Bio-Rad装置将SDS-PAGE凝胶上的蛋白进行转膜。经封闭液封闭后，加入蛋白特异性一抗，进行过夜处理。最后加入辣根过氧化物酶二抗，反应 2 小时。经发光液发光后用X-ray底片曝光处理。

作者贡献
左然完成该研究的实验结果分析及写作工作，徐美玲主要参与了该研究的实验内容，温泽文参与实验数据分析，张东远对本研究进行了实验设计。

致谢
感谢国家自然基金面上项目(31070217)的资助，感谢匿名评审专家的评审建议和修改建议。

参考文献
Chuang C.F., and Meyerowitz E.M., 2000, Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(9): 4985-4990
http://dx.doi.org/10.10 73/pnas.060034297

Earley K.W., Haag J.R., Pontes O., Opper K., Juehne T., Song K., and Pikaard CS., 2006, Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics, Plant J., 45(4): 616-629
 http://dx.doi. org/10.1111/j.1365-313X.2005.0 2617. x  PMid:16441352

Friso G., Giacomelli L., Ytterberg AJ., Peltier JB., Rudella A., Sun Q., and van Wijk KJ., 2004, In-depth analysis of the thylakoid membrane proteome of Arabidopsis thaliana chloroplasts: new proteins, new functions, and a plastid proteome database, Plant Cell, 16(2): 478-499
http://dx.doi.org/10.1105/tpc.017814 PMid:14729914    PMCid:341918

Hannon G.J., 2002, RNA interference, Nature, 418(6894): 244-251
http://dx.doi.org/10.1038/418244a PMid:12110901

Laemmli U.K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227: 680-685 
 http://dx.doi.org/10.1038/227680a0 PMid:5432063

Leister D., 2003, Chloroplast research in the genomic age, Trends in Genetics, 19(1): 47-56 
 http://dx.doi.org/10.1016/S0168-9525(02)00003-3

Leontiadou F., Triantafillidou D., and Choli-Papadopoulos T., 2001, On the characterization of the putative S20-Thx operon of Thermus thermophilus, Biol. Chem., 382(7): 1001-1006
http://dx.doi.org/10.1515/ BC.2001.126 PMid:11530930

Long S.P., Humphries S., and Folkowski P.G., 1994, Photoinhibition of photosynthesis in nature, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 45(1): 633-662
http://dx.doi.org/10.1146/annurev.pp.45.060194.00 3221

Martin W., Rujan T., Richly E., Hansen A., Cornelsen S., Lins T., Leister D., Stoebe B., Hasegawa M., and Penny D., 2002, Evolutionary analysis of Arabidopsis, cyanobacterial, and chloroplast genomes reveals plastid phylogeny and thousands of cyanobacterial genes in the nucleus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(19): 12246-12251
http://dx.doi.org/10.1073/pnas.182432999 PMid:12218172    PMCid:129430

Morita-Yamamuro C., Tsutsui T., Tanaka A., and Yamaguchi J., 2004, Knock-out of the plastid ribosomal protein S21 causes impaired photosynthesis and sugar-response during germination and seedling development in Arabidopsis thaliana, Plant Cell Physiol., 45(6): 781-788  http://dx.doi.org/10.1093/pcp/pch093 PMid:15215513
 
Neuhaus H.E., and Emes M.J., 2000, Nonphotosynthetic metabolism in plastids, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51: 111-140
http://dx.doi.org/10.1146/annurev.arplant.51.1.111 PMid:15012188

Pesaresi P., Varotto C., Meurer J., Jahns P., Salamini F., and Leister D., 2001, Knock-out of the plastid ribosomal protein L11 in Arabidopsis: effects on mRNA translation and photosynthesis, Plant J., 27(3):179-189
http://dx.doi.org/10.1046/j.1365-31 3x.2001.01076.x PMid:11532164

Schultes N.P., Sawers R.J.H., Brutnell T.P., and Krueger R.W., 2000, Maize high chlorophyll fluorescent 60 mutation is caused by an Ac disruption of the gene encoding the chloroplast ribosomal small subunit protein 17, Plant J., 21(4): 317-327 http:// dx.doi.org/10.1046/j.1365-313x.2000.00676.x PMid:10758483

Yamaguchi K., and Subramanian AR., 2000, The plastid ribosomalproteins: Identification of all the proteins in the 30S subunit of an organelle ribosome (chloroplast), J. Biol. Chem., 275(37): 28466-28482  
http://dx.doi.org/10.1074/jbc. M004 350200 PMid:10874039 http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M005012200 PMid:10874046
 
Yamaguchi K., and Subramanian A.R., 2003, Proteomic identification of all plastid-specific ribosomal proteins in higher plant chloroplast 30S ribosomal subunit, Eur. J. Biochem., 270(2): 190-20
 http://dx.doi. org/10.1046/j.1432-1033. 2003.0 3359.x PMid:1260567