众所周知，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)的特征是能够在产生芽孢的同时伴随产生伴孢晶体蛋白(parasporal crystal proteins)，也称为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, 简称ICPs)。绝大部分杀虫晶体蛋白(ICPs)的表达依赖于芽孢形成，即只有在芽孢形成期才会产生杀虫晶体蛋白(ICPs) (Liu et al., 2010; Liu et al., 2011)。但Cry3Aa是一个例外，Cry3Aa蛋白的表达发生在营养期并在芽孢形成期结束(Schnepf et al., 1998)。研究表明，cry3Aa基因的启动子序列不同于其它ICP基因的启动子，cry3Aa基因的转录依赖于细胞营养期特有的ςA因子。而其它ICP基因的表达必须得到芽孢形成期ςE因子和ςK因子的激活才能进行(Schnepf et al., 1998)。那么，是否可以利用cry3Aa基因的启动子来驱动其它的cry基因表达杀虫晶体蛋白，从而实现在苏云金芽孢杆菌的营养期表达伴孢晶体蛋白呢？

本研究试图设计一个能在苏云金芽孢杆菌的营养期表达的杀虫晶体蛋白表达载体。为此，选用了苏云金芽孢杆菌拟步虫甲亚种(Bt subsp. Tenebrions, Btt)的DNA作为模板，根据已知cry3Aa基因启动子设计了一对引物(C3-5和C3-3)，利用PCR方法扩增出了目的片段为575 bp的DNA片段，并将该片段克隆到pBU4载体上建成一个pBUC3载体。随后，我们将cry1Ac31基因连接到pBUC3载体中，最后，将将含有cry1Ac31基因的表达载体通过电脉冲转化法转入Bt无晶体突变株IPS，通过PCR、镜检和SDS-PAGE进行验证，为进一步开展多基因的表达提供新的途径。

1结果与分析
1.1 cry3Aa启动子基因的获得
我们设计一对引物C3-5/C3-3，利用Pfu DNA聚合酶，以Btt的DNA模板进行PCR扩增获得575 bp目的片段(图1)。测序测定分析表明该片段的-35区域(GATTAAGA)存在于402 bp到409 bp之间，-10区(TATAAATT)存在于425 bp到433 bp之间。转录起始位点在438 bp处，STAB-SD序列(GAAAGGAGG)在443 bp到451 bp之间。核糖体结合位点(RBS)  (GAAAGGGAGG)在550 bp到560 bp之间。获得的启动子片段包含了完整的启动子结构域(图2)。

图1 PCR扩增获的启动子片段 Figure 1 The promoter fragment amplified by PCR

图2 扩增的启动子序列及其结构域分析 Figure 2 Sequence analysis of the amplified promoter and its domain structure

1.2 Bt营养期表达载体pBUC3的构建
我们将获得的575 bp的启动子序列连接到pBU4载体上建成一个pBUC3载体。阳性克隆子经过PCR鉴定含有575 bp的启动子片段(图3)。进一步用FokⅠ酶切阳性克隆发现1号克隆子酶切图谱与Vector NTI软件分析结果一致，出现了一条526 bp的特征条带(图4)。最终测序结果验证了1号克隆子是符合本研究设计目标的Bt营养期表达载体，将该克隆子命名为pBUC3。

图3 PCR筛选阳性克隆子 Figure 3 Positive clones screened by PCR

图4 FokⅠ酶切分析1号克隆子 Figure 4 Restriction enzymetic analysis of recombinant plasmid (No.1) digested by FokⅠ

1.3 cry1Ac31基因在Bt IPS中的表达
我们将cry1Ac31基因连接到pBUC3载体上，构建成pBUC3-1Ac31，通过电脉冲转化法转化Bt无晶体突变株IPS中。通过PCR扩增筛选阳性克隆子，结果显示挑取的3个克隆子均出现了目的条带(图5)。利用光学显微镜对Bt IPSC3-1进行观察，可以直观看出IPSC3-1已经能产生了大量菱形杀虫晶体，而同时期的Bt S3299-1以及IPS均无菱形晶体产生(图6)。随后的SDS-PAGE蛋白电泳可以看出(图7)，IPSC3-1在12 h就能够产生130 kD蛋白带，而IPS和Bt S3299-1均无蛋白带产生。由此可以证明，cry1Ac31基因在IPS中得到了较好的表达。

图5 PCR筛选阳性克隆子                    Figure 5 PCR for screening positive clones

图6 菌株生长18 h时的光学镜检观察 Figure 6 Light micrographs of the tested strains observed after 18 hours culture

图7 Cry1Ac31晶体蛋白的SDS-PAGE分析 Figure 7 Cry1Ac31 protein generated after 18 hours culture identified by SDS-PAGE

2讨论
由于pBU4载体拥有EcoRⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、XmaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、PstⅠ、SphⅠ和 HindⅢ 10个多克隆酶切位点，对Amp和Tc有抗性，能够在大肠杆菌和芽孢杆菌中穿梭复制，因此，本研究构建的pBUC3是一个拥于pBU4特点，能在大肠杆菌和芽孢杆菌中均能大量的复制表达，这个特点是该载体能够电转化芽孢杆菌并大量表达蛋白的先决条件。由于pBUC3拥有了能够在芽孢杆菌中表达的强启动子，并且其表达不依赖于芽孢期的到来就能大量表达，因此，在实际的应用中，菌体培养的时间比依赖于芽孢形成而表达的载体大为缩短。

不同的ICP基因在同一菌株中的表达，由于都集中在芽孢期，相互之间具有竞争性(Sanchis et al., 1989)。因此我们可以假设，将两种杀虫蛋白基因一个在营养期表达，另外一个在芽孢期表达，这样其表达效果可能会比同时在芽孢期表达为好。进一步推想，同一种ICP基因如果既能在营养期表达又能在芽孢期表达，那么表达量也可能比只在营养期或芽孢期表达的表达量要高很多。

3材料与方法
3.1菌株与质粒
本研究所用的菌株与质粒列于表1。其中Bt菌株S3299-1为携带cry1Ac31基因的野生菌株，由海南省热带农业资源研究所分离；Bt菌株IPS为无晶体Bt突变株有英国Univershity of Sussex 的Neil Crickmore博士赠送。

表1 本研究所用菌株与质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this research

3.2培养基、抗生素与试剂
LB液体培养基及固体培养基用于培养Bt和E. coli；SOC培养基用于电转化后的感受态细胞的复苏。Bt培养温度为30℃，E. coli培养温度为37℃。氨苄青霉素和四环素使用浓度分别100 ug/mL和50 ug/mL。PCR反应试剂购自大连宝生物工程有限公司，PCR引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。Pfu DNA聚合酶及T₄DNA聚合酶购自上海生物工程有限公司。限制性内切酶及T₄DNA连接酶从MBI公司购买。Taq DNA聚合酶由海南省热带农业资源研究所提供。

3.3 cry3Aa启动子PCR扩增及其产物回收
根据cry3Aa启动子设计一对引物C3-5/C3-3，序列为：C3-5：5’-AGCTTAATTAAAGATAATATCTTTGAA-3’；C3-3：5’-GGATTCATTTTTCTTCCTCCCTTTCTT-3’。

以Bt菌株Btt总DNA作为模板，利用本研究设计的引物C3-5/C3-3和Pfu DNA聚合酶进行扩增cry3Aa启动子，扩增产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收及纯化。PCR反应条件参照Song等(1998)的方法进行。

携带pBUC3的E.coli阳性克隆子的筛选也是使用引物C3-5/C3-3，以克隆子质粒DNA作为模板，使用Taq DNA聚合酶扩增。携带pBUC3-1Ac31的IPS阳性克隆子筛选以克隆子总DNA作为模板，分别采用引物C3-5/C3-3和K2-5/K2-3，使用Taq DNA聚合酶扩增。

3.4 Bt营养期表达载体pBUC3的构建
用限制性内切酶EcoRⅠ在37℃水浴中完全消化质粒pBU4，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收、纯化后，利用T₄DNA聚合酶补平粘性末端。接着用等体积异丙醇置-20℃沉淀10 min，12 000 r/min离心10 min回收沉淀物，加入10 μL TE溶解。随后，利用T₄DNA连接酶将通过PCR获得的cry3Aa启动子片段和补平末端后的载体pBU4连接，转化大肠杆菌JM110，在含有氨苄青霉素(100 ug/mL)和四环素(50 ug/mL)的LB培养基平板进行重组子筛选，用PCR (引物C3-5/C3-3)和酶切克隆子质粒的方法鉴定阳性克隆，通过序列测定进一步确定启动子序列是否正确插入pBU4质粒中。获得的表达载体命名为pBUC3。

3.5 cry1Ac31基因在IPS中的表达
用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ在37℃水浴中完全消化重组质粒pCRY1Ac31和载体pBUC3，消化产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收和纯化后，利用T₄连接酶将cry1Ac基因全长序列和表达载体pBUC3连接，电转化表达宿主苏云金芽孢杆菌无晶体突变株IPS中。在含有氨苄青霉素(100 ug/mL)和四环素(50 ug/mL)的LB培养基平板进行重组子筛选，用PCR扩增鉴定阳性克隆。验证后的阳性克隆子接种到LB固体培养基培养12 h后，显微镜观察其伴胞晶体产生情况，最后用7.5%胶进行SDS-PAGE电泳分析验证表达情况。

鉴定cry1Ac基因的通用引物为K2-5/K2-3序列：K2-5：5’-AGGACCAGGATTTACAGGAGG-3’；K2-3：5’-GCTGTGACACGAAGGATATAGCCAC-3’。Bt菌株电转化感受态制备及电转化参考分子克隆实验指南(Sambrook et al., 1989)；显微镜观察方法参照谢柳等(2009)的方法，SDS-PAGE电泳分析方法参照(Liu et al., 2010)。

作者贡献
刘辰是本研究的实验设计和实验研究执行人；张文飞和周燕参与数据分析，论文写作与修改；李有志指导实验设计，试验结果分析和论文修改和写作。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究受本研究受中国Bt收集与鉴定项目的资助。本研究的部分工作是在李有志教授的实验室完成的，感谢该实验室在过程中的技术支持和有益的建议。感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。本文中提到了我们实验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商，这并非我们为这些试剂供应商和测序服务商的产品和服务提供推荐或背书。

参考文献
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