人体内乙醛脱氢酶可将酒精代谢的中间产物乙醛转化生成二氧化碳和水(Ishikawa et al., 2003)。乙醛是毒性很强的物质，可使人产生脸红、恶心、呕吐、全身盗汗、情绪烦躁，严重时会导致休克(罗怀容和张亚平, 2004)。人体内的乙醛氧化主要由乙醛脱氢酶ALDH1和ALDH2来完成，而ALDH2对乙醛的活性较ALDH1高出约10~50倍(Vasiliou et al., 2000)。中国和其他亚洲国家中，35%~40%的个体缺乏ALDH2，更易产生酒精中毒(王焱等, 2010)。高活性乙醛脱氢酶的补充可以弥补内源性乙醛脱氢酶的不足，从根本上解除乙醇和乙醛毒害。因此，乙醛脱氢酶在解酒制剂的开发、疾病的诊断、食品生产等方面的应用日益受到重视。随着酶固定化、基因工程和DNA重组技术的发展，乙醛脱氢酶的应用领域也将更为广泛(Lassen et al., 2005;Wang et al., 2009; Zhao et al., 2009; Nakamura et al., 2010)。

目前，商品化乙醛脱氢酶主要是从动物的肝脏、胰腺或肝细胞线粒体中分离提取，资源有限且价格昂贵，大规模生产困难(吴桂英等, 2007, 食品工业科技, 28(3): 61-63)。为了拓展乙醛脱氢酶的来源，国内外科学工作者开始探索利用微生物发酵方法获取高活性的ALDH2，并初步实现其在大肠杆菌、毕赤酵母和植物体内的重组表达(刘清利等, 2006)。毕赤酵母分泌表达人ALDH2时，由于在表达过程中酵母的生长周期较长，分泌的蛋白失活现象严重(黄锟等, 2010)。利用大肠杆菌表达人ALDH2培养周期短，但主要以包涵体形式存在(杨晓仪等, 2004)。类似于自然折叠最快的蛋白——泛素，SUMO蛋白也有一个外部亲水性的表面和内部疏水性的核心，因此在N端融合SUMO蛋白可以增加外源蛋白的可溶性表达(Malakhov et al., 2004; Marblestone et al., 2006)。

本文通过在原核表达载体中添加SUMO 标签和诱导条件的优化，探索了人ALDH2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。期望能够得到有活性的ALDH2，为进一步研究乙醛脱氢酶在乙醇有效分解中的作用奠定基础。

1 结果与分析
1.1 目的片段的克隆与表达载体的构建
根据人ALDH2的基因序列(GenBank登录号: JF432260)和His-SUMO标签蛋白的基因序列(GenBank登录号: GU456634)设计引物。首先，将SUMO蛋白基因与人ALDH2克隆，并连接到克隆载体pMD19-T中，构建克隆载体pMD19-T-His- SUMO-ALDH。pMD19-T-His- SU MO-ALDH2递交大连宝生物公司进行序列测定，测序结果表明此片段序列与报道序列一致。然后，将目的片段克隆构建到表达载体空载pET28a(＋)中，获得表达载体pET28a-His-SUMO-ALDH2。PCR 鉴定获得一条1801 bp的特异性的目标条带与预期目的片段大小一致(图1)。

图1 ALDH2 的PCR 扩增结果 Figure 1 Identification of the recombinant plasmid SUMO-ALDH2

1.2 SUMO-ALDH2融合蛋白的诱导表达
将构建的表达质粒导入大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)中进行体内表达。37℃诱导表达3 h后，收集菌体。经SDS-PAGE和 Western blot确定重组酶的人ALDH2表达(图2)。

图2 ALDH2在大肠杆菌中37℃诱导表达 Figure 2 SDS-PAGE and Western blot analysis of expressed product

1.3 诱导表达条件中IPTG 浓度的选择
诱导温度是37℃，诱导时间为3 h，IPTG的终浓度是0.1 mol/L 时，目的蛋白开始表达，说明重组菌对IPTG十分敏感，较低浓度的IPTG 能够使目的基因高效表达。通过对IPTG的浓度(0 mol/L, 0.1 mol/L, 0.2 mol/L, 0.3 mol/L, 0.4 mol/L, 0.5 mol/L, 0.8 mol/L, 1 mol/L)优化可见，37℃条件下，IPTG的终浓度0.3 mol/L时，ALDH2蛋白的表达量不再因IPTG 浓度的增加而增加。因此，确定最佳的IPTG诱导浓度是0.3 mol/L。SDS-PAGE及凝胶成像系统UVP-GDS8000对结果分析如图3。

图3 SUMO-ALDH2在不同浓度IPTG下的表达水平 Figure 3 Variation of SUMO-ALDH2 expression level at different IPTG concentrations

1.4 诱导表达条件中时间的选择
进一步对诱导时间的优化。在37℃，IPTG的浓度为0.3 mol/L诱导条件下，SUMO-ALDH2的表达量随诱导时间的增加而增加，至3h时达到最高，之后SUMO-ALDH2的表达不再随时间的增加而增加。因此最佳诱导时间为3h。根据以上条件，该工程菌的SUMO-ALDH2融合蛋白占全菌总蛋白的16%。

综上，在诱导温度是37℃时，诱导时间为3 h，IPTG的浓度达到0.3 mol/L时，表达效率达到最高。SDS-PAGE及凝胶成像系统UVP-GDS8000 对结果分析如图4。

图4 SUMO-ALDH2 在不同诱导时间的表达水平 Figure 4 Variation of SUMO-ALDH2 expression level at different induction time

1.5 温度对可溶性蛋白的影响
37℃是菌体生长的最适宜温度，表达量较高。但SUMO蛋白标签的引入，仅部分提高了目的蛋白的可溶性表达，重组蛋白仍以包涵体形式存在。这主要是因为快速的表达影响蛋白的正确折叠。降低诱导温度，可增加可溶性蛋白的表达量。选择在30℃、16℃，分别对目的蛋白进行诱导表达3 h、16 h后，将菌体高压匀浆破碎后取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳，可见16℃诱导条件下，目的蛋白主要以可溶形式表达(图5)。

图5 30℃, 37℃, 16℃诱导表达目的蛋白SDS-PAGE电泳结果 Figure 5 SDS-PAGE analysis of expressed product at 30℃, 37℃, 16℃

1.6 可溶性蛋白的分离纯化
根据亲和层析原理，目的基因含有His标签，能与Ni特异性相结合。16℃诱导表达后将菌体破碎后上清缓慢通过上样柱，最后进行梯度洗脱。在250 mmol/L咪唑的洗脱液中得到纯化蛋白(图6)。

图6 16℃目的蛋白的分离纯化 Figure 6 SDS-PAGE analysis of purified target protein at 16℃

2 讨论
本实验中通过对表达载体的重新构建，实现了人乙醛脱氢酶2在大肠杆菌内的高效表达。在载体中加入SUMO蛋白标签，可部分提高目的蛋白的可溶性表达。在C 段加上6×His标签以便于分离纯化。

在诱导条件的优化中，分别考察诱导剂和诱导时间对目的蛋白的表达的影响。在37℃、IPTG的浓度达到0.3 mol/L、诱导时间为3 h时，目的蛋白就会有较高的表达量。通过对诱导条件的摸索，确定温度是影响目的蛋白表达量的最主要因素。37℃是大肠杆菌表达目的蛋白的最适宜的温度，表达量较高，但快速的表达会影响蛋白的正确折叠，因此通过高压匀浆破碎后，溶解在上清液中目的蛋白的量较低，大多目的蛋白以包涵体的形式存在。16℃诱导表达后，在上清中有较多的目的蛋白，低温诱导有利于蛋白的正确折叠。可溶性蛋白相对于包涵体来说，一般具有活性，不需要进行复性等繁琐的摸索过程，同时纯化方便。

3 材料与方法
3.1 实验材料　
质粒pMD19-T-ALDH2为本实验室保存。质粒pMD19-T、pET28a(＋)、宿主BL21(DE3)均购自TaKaRa公司。

3.2 仪器与试剂
质粒提取试剂盒、DL2000分子量Marker购自TaKaRa公司；氨苄青霉素、卡那霉素、IPTG 均购自Sigma 公司，其它常规试剂均为分析纯级。

3.3 基因克隆与表达载体的构建
3.3.1 pMD19-T-His-SUMO-ALDH2克隆载体的构建
根据人ALDH2的基因序列(GenBank登录号: JF432260)和His-SUMO标签蛋白的基因序列(GenBank登录号: GU456634)，设计如下引物F1、R1、F2、R2。F1含有Nde I酶切位点(下划线)，以利于与载体pET28a(＋)相连，R1含有NspV 位点(下划线)，以利于与ALDH2基因的连接，R1中同时含有SUMO蛋白酶的酶切位点，以利于将SUMO蛋白从目的片段上切割下来；F2中含有NspV位点(下划线)，以利于与SUMO基因相连接，P2中含有EcoR I的酶切位点(下划线),以利于与载体pET28a(＋)相连。

F1：5’-CGCGCGGCAGCCATATGGGTCATCACCATCA-3’；     
R1：5’-GCGCTTGTCTAACCTCCAATACCTTTTCGAAGCTTGG；
                                                          ↑                
                                     SUMO蛋白酶的酶切位点                      
F2：5’-GCTTCGAACCATGTTGCGCGCTGCCGCC-3’；
R2：5’ -GACGGAGCTCGAATTCCTATGAGTTCTTCTGAGGCA-3’

将His-SUMO基因片段和ALDH2连接到克隆载体pMD19-T中。将连接产物取1 uL热转化至E. coli Competent Cell JM109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取单菌落进行检测，筛选阳性克隆。构建的载体命名为pMD19-T-His-SUMO-ALDH2 (图7)。送交TaKaRa公司进行测序。

图7 克隆载体pMD19-T-SUMO-ALDH2的构建 Figure 7 Construction of plasmid vector pMD19- T-SUMOAL DH2

3.3.2 pET28a-His-SUMO-ALDH2表达载体的构建
 pMD19-T-His-SUMO-ALDH2测序成功后，构建表达载体。利用空载pET28a(＋)上原有的His标签，以及引物F1和P2，以pMD19-T-His-SUMO-ALDH2克隆载体为模板，使用PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (Code No.DR010S)扩增，切胶回收目的片段。用Nde I与 EcoR I将空载pET28a(＋)进行双酶切，切胶回收目的片段。将上两种回收产物利用T4 DNA 连接酶进行连接。结构图示如图8。

图8 含有SUMO-ALDH2基因表达载体的构建 Figure 8 Schematic diagram of plasmid vector with the SUMO- ALDH2 gene

将连接产物取1 uL 热转化至E. coli Competent Cell JM109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取单菌落进行检测，筛选阳性克隆。提取质粒命名为pET28a-His-SUMO-ALDH2。

3.4 目的基因的诱导表达
首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后将含目的基因质粒的转化至BL21(DE3)plysS感受态细胞中，在含有Kan的LB平板上涂板，37℃ 培养12 h。菌体培养后提取质粒并电泳、双酶切检测重组菌是否含有目的基因条带。提取的质粒转化至表达菌株BL21(DE3)中。在克隆菌株中挑取抗氨苄青霉素阳性克隆，提取质粒，由大连宝生物生物技术有限公司测序鉴定。提取的质粒使用PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (Code No.DR010A)，进行PCR扩增。

从平板上挑取重组菌单菌落接到含有Kan的LB培养基中，37℃摇床中200 r/min下过夜活化培养。将活化好的重组菌按照1%的接种量接到新的含有Kan的LB培养基中，培养至OD_600nm=0.6，加入100 mol/L的IPTG (终浓度为1 mol/L)，进行诱导，至OD_600nm=1.6，将培养的菌液在9 000 r/min下离心10 min，收取沉淀，高压匀浆破碎后进行电泳。

3.5 表达条件的优化
目的基因的表达主要受三种条件的影响：诱导温度、IPTG的浓度、诱导时间。大肠杆菌生长的最适温度是37℃。首先在37℃条件下，选取不同的IPTG的浓度：0 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.8 mol/L、1 mol/L诱导表达3 h。选取表达量最高的IPTG的浓度。在此浓度下，37℃诱导表达1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h进行SDS-PAGE电泳及凝胶成像系统UVP-GDS8000分析，确定最适诱导表达条件。

3.6 Western Blotting检测
Western blotting将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。首先是蛋白质的电泳分离，然后将电泳后凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域，最后进行免疫学检测。其中一抗为鼠源组氨酸标签，二抗为HRP标记兔抗鼠标签。配置显影定影液将PVDF膜上的印记在暗室中转至胶片上。

3.7 目的基因的纯化
根据亲和层析原理，目的基因C 段含有His标签，能与Ni特异性相结合。将菌体破碎后上清缓慢通过上样柱，最后进行梯度洗脱。收集洗脱峰后进行SDS-PAGE电泳，分析结果。

作者贡献
通讯作者李智博以及杨君负责本研究的实验设计及安排，第一作者孙莉负责论文整个实验的具体实施及分析，其他作者均参与了本实验的研究工作。

致谢
感谢大连理工大学和大连海洋大学同组老师和同学们的支持和帮助。感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。

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