3-羟酰辅酶A脱氢酶是一类氧化还原酶，主要参与线粒体脂肪酸氧化过程。这类酶催化线粒体脂肪酸氧化的第三步，将3-羟酰基-辅酶A脂类转移到相应的3-酮脂酰CoA脂类上。3-羟酰辅酶A脱氢酶属于线粒体三功能蛋白(MTP)的一部分，其中包含烯酰辅酶A水合酶和硫解酶活性(Carpenter et al., 1992; Uchida et al., 1992)。根据β氧化中脂肪酸的碳链长度，3-羟酰辅酶A脱氢酶可分为长链3-羟酰辅酶A脱氢酶、中链3-羟酰辅酶A脱氢酶和短链3-羟酰辅酶A脱氢酶。迄今为止，研究最为深入的是3-羟酰辅酶A脱氢酶活性的缺失。长链3-羟酰辅酶A脱氢酶的活性的缺失是由于线粒体三功能蛋白部分突变导致酶活性的降低或丧失，例如，G985A基因和G1528C基因的突变(IJlst et al., 1997)。然而，短链3-羟酰辅酶A脱氢酶活性的缺失涉及Schad基因的突变(Eaton et al., 2003)。经临床研究表明，3-羟酰辅酶A脱氢酶活性的缺乏主要导致低血糖症(den Boer et al., 2002)。

家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)。其基因组由10节段dsRNA组成，根据基因组dsRNA电泳谱，目前把质型多角体病毒分成12个电泳型，家蚕质型多角体病毒为I型。该病毒是家蚕的主要病毒病原之一，常给养蚕业带来巨大的经济损失(Ikeda et al., 2001; Qanungo et al., 2002)。目前，有关家蚕对BmCPV的防御机制的研究报道很少。以寻找家蚕感染质型多角体病毒相关应答基因为前提，正确理解病毒对家蚕感染致病的分子机制，对家蚕质型多角体病的防控及蚕药的研发具有重要的意义。

本实验室利用基因芯片(gene chip)技术分析家蚕感染BmCPV相关基因时，检测到了3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因的表达下调(Wu et al., 2011)。本研究克隆了家蚕的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因的全长cDNA，将其命名为Bm3HAD，分析了基因结构，并运用荧光定量PCR方法检测了该基因在正常家蚕及BmCPV感染家蚕中肠组织中的差异性表达，为深入研究该基因在家蚕对BmCPV感染应答调控中的作用奠定了基础。

1结果与分析
1.1 Bm3HAD基因的5’端与3’端克隆
根据家蚕Bm3HAD基因EST序列，以合成的第一链cDNA为模板，应用RACE方法，克隆获得该基因EST序列的5’端和3’端RACE产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，测序结果证明为目的序列。由图1A和图1B可看出，Bm3HAD 5’端与3’端扩增结果良好，5’扩增片段约为250~500 bp，3’扩增片段约为1 000 bp。

图1 Bm3HAD 基因的3’端与基因的5’端的PCR扩增结果 Figure 1 Amplification result of the 5’ end of Bm3HAD

1.2 Bm3HAD基因的序列与结构分析
1.2.1 Bm3HAD基因全长cDNA序列分析
利用RACE技术克隆获得了Bm3HAD基因，该基因全长cDNA为1 168 bp，其中包含83 bp的5’非翻译区和155 bp的3’非翻译区，开放阅读框930 bp，编码310个氨基酸(图2)。GenBank登录号为HQ833817。

图2  Bm3HAD基因全长cDNA序列及其推导氨基酸序列 Figure 2Full-length cDNA sequence of Bm3HAD gene and its deduced amino acid sequence

 1.2.2 Bm3HAD基因结构分析 
应用Blastn (NCBI,http://www.ncbi.nlm.gov/blastn)将克隆获得的家蚕Bm3HAD基因全长cDNA序列与家蚕基因组数据库进行比对，发现该序列位于登录号为BABH01027674.1的家蚕基因组序列内。根据比对结果，从该序列中提取了12 794~19 585 bp的序列片段，对Bm3HAD基因进行结构分析。结果表明该基因包含5个外显子，4个内含子，第5外显子为最大，长度368 bp，第3外显子最小，为83 bp，见图3。外显子与内含子交界处均符合“GT-AG”剪切规则。外显子的大小与位置见表1。

图3家蚕Bm3HAD基因结构示意图 Figure 3 Gene structure of Bm3HAD

1.2.3蛋白质一级结构分析 
采用ProtParam软件(www.expasy.ch/tools/protparam.html)对Bm3HAD基因编码的蛋白质进行一级结构预测，结果表明家蚕Bm3HAD基因编码310个氨基酸，其分子量约为33.6 KD，等电点为9.0，不稳定指数为21.34，提示该蛋白为一个稳定蛋白。在家蚕Bm3HAD基因编码的蛋白质氨基酸组成中，相对较多的氨基酸包括Lys (32个, 10.3%)、Val (29个, 9.4%)、Ala (26个, 8.4%)和Gly (26个, 8.4%)，氨基酸组成如表2所示。

表1 Bm3HAD基因的外显子特性 Table 1 Characteristics of exons in Bm3HAD

表2家蚕Bm3HAD蛋白的氨基酸组成 Table 2 Amino acid components of Bm3HAD protein from silkworm

1.2.4 氨基酸序列同源性比对
根据家蚕Bm3HAD蛋白氨基酸序列，经NCBI上的Blastp 软件比对分析，获得不同物种的同源序列。家蚕Bm3HAD编码的氨基酸序列与谷蛀虫(Tribolium castaneum) 3HAD (XP_973042.1)有71%的相似性，与豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的两个Bm3HAD蛋白(NP_001155916.1和BAH70529.1)的相似性均为66%。利用MEGA 3.1软件构建了几种昆虫3HAD的系统进化树，如图4所示。

图4几种昆虫Bm3HAD同源序列的系统进化树 Figure 4 Phylogenetic tree of Bm3HAD homologous sequences from several insects

1.3 Bm3HAD基因在不同组织中表达分析
用荧光定量PCR方法检测发现，Bm3HAD基因在家蚕的中肠、血液、脂肪体、丝腺及生殖体中都有表达，但表达水平不同，在中肠组织中的表达量最高，在血淋巴中的表达量为最低。在BmCPV感染48 h后，该基因在蚕体各组织中表现出差异表达，在脂肪体和血淋巴中该基因被上调表达，而在中肠、丝腺和生殖体中该基因均被下调表达，见图5。

图5 Bm3HAD在蚕体各组织的相对表达水平及BmCPV感染导致的差异表达 Figure 5 Relative expression analysis of Bm3HAD in different tissues and its differential expression in BmCPV-infected silkworm.

1.4 Bm3HAD基因在BmCPV感染家蚕中肠的表达差异
家蚕中肠组织的荧光定量PCR结果表明，在健康对照蚕中肠组织中，Bm3HAD基因的表达水平逐渐提高。而在BmCPV感染蚕中肠组织，Bm3HAD基因在感染后24 h的表达水平呈现上调趋势，然后逐渐降低，至感染后48 h即呈现下调表达，至感染后72 h该基因表达水平的下调幅度更为显著；此时该基因在正常中肠组织的表达水平显著高于BmCPV感染中肠组织中的表达水平，Ct值分别为24.69±0.04和22.79±0.19，正常蚕中肠中该基因的表达水平是BmCPV感染中肠中的8.2倍(图6)。

图6 Bm3HAD在BmCPV感染中肠的相对表达水平 Figure 6 Relative transcript level of Bm3HAD in BmCPV-infected midgut of silkworm

 
2讨论
质型多角体病毒(cytoplasmic polyhedrosis virus, CPV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)。家蚕质型多角体病毒(BmCPV)感染家蚕中肠上皮组织并在柱状细胞的细胞质中繁殖，形成包裹病毒粒子的包涵体。基因组由10节段双链RNA分子组成(Watanabe et al., 2002; Sun et al., 1982)。关于昆虫对病原物的免疫机制，目前研究较为广泛和深入的是昆虫对细菌及真菌的免疫与应答。但有关昆虫对病毒感染的应答反应及其分子机制的研究尚无突破性进展。本研究的目的是为探索BmCPV感染家蚕的分子机制提供相关依据。

本研究利用RACE技术，在家蚕中肠中克隆获得一个3-羟酰辅酶A脱氢酶(Bm3HAD)基因，该基因全长cDNA序列为1 168 bp，其中ORF为930 bp，编码 310个氨基酸的蛋白质，分子量为33.6 kD；该基因由5个外显子和4个内含子组成。利用生物信息学软件对该基因进行分析，该基因属于NADB-Rossmann superfamily和Bm3HAD superfamily。因此，将该基因命名为Bm3HAD (Bombyx mori 3-hydroxyacyl-coA dehyrogenase, Bm3HAD)。物种同源性分析表明，Bm3HAD与其它所知物种的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白相比同源性较高，尤其是与谷蛀虫的同源性最高。系统进化分析显示，Bm3HAD与谷蛀虫3-羟酰辅酶A脱氢酶(XP_973042.1)聚为一类，说明Bm3HAD与谷蛀虫3-羟酰辅酶A脱氢酶具有相似的功能。荧光定量PCR结果表明，Bm3HAD在感染病毒后24 h表现上调表达，然而随着病情的进展，其表达水平逐渐降低，并表现为下调表达，至感染后72 h，该基因在感染蚕中肠中的的表达量与在正常蚕中肠中的表达量相比，其表达量降低8.2倍。该基因的表达量趋势与本实验室基因芯片分析的趋势一致。Bm3HAD基因在BmCPV感染蚕中肠中的表达水平随着病毒感染的进展而逐渐降低，由上调表达逐渐转变为下调表达，而在健康对照蚕中肠组织该基因的表达水平在相对应的时间段内却呈现逐渐提高的趋势。Bm3HAD基因在BmCPV感染蚕中肠中表达水平的这种变化，暗示Bm3HAD基因可能与BmCPV感染家蚕的进程有关。

脂肪酸是机体重要的能量资源，脂肪酸由不同长度的碳链组成，它分为长链脂肪酸、中链脂肪酸和短链脂肪酸。当脂肪酸不能提供机体所需要的能量时，会导致机体产生脂肪酸病症。3-羟酰辅酶A脱氢酶是脂肪酸氧化过程中一种重要的酶，该酶主要起将3-羟酰基-辅酶A脂类转移到相应的3-酮脂酰CoA脂类上的作用，其中伴随能量的产生，缺乏该酶会阻断脂肪酸产生能量供给机体。近年来研究发现，3-羟酰辅酶A脱氢酶是三联功能性蛋白(TFP)的一部分，三联功能性蛋白(TFP)的部分突变会导致3-羟酰辅酶A脱氢酶活性缺乏(Carpenter et al., 1992)。因此，长链3-羟酰辅酶A脱氢酶的G985A基因和短链3-羟酰辅酶A脱氢酶的Schad基因突变等三联功能性蛋白(TFP)亚单位的突变导致3-羟酰辅酶A脱氢酶活性缺乏(IJlist et al., 1994; Molven et al., 2004)。1990年3-羟酰辅酶A脱氢酶缺乏方面的研究被报道后(Wanders et al., 1990)，3-羟酰辅酶A脱氢酶缺乏研究的生物学和临床价值被人们所关注。近年来，3-羟酰辅酶A脱氢酶缺乏的临床研究较为广泛。儿童3-羟酰辅酶A脱氢酶缺乏会导致低血糖症甚至眼部和神经的并发症。但是，昆虫3-羟酰辅酶A脱氢酶的研究相对较少，3-羟酰辅酶A脱氢酶的相关生物学特点和功能尚不清楚，特别是其在家蚕对BmCPV感染的应答反应中的作用有待今后深入研究。

本文首次报道了在家蚕中肠中克隆获得的一个3-羟酰辅酶A脱氢酶基因(Bm3HAD)。但是，该基因在家蚕体内的功能仍不清楚。目前，研究该基因唯一的线索来自于该基因与谷蛀虫3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白等较高的同源性，但是还没有实验依据证明该基因的表达产物具有3-羟酰辅酶A脱氢酶的活性。3-羟酰辅酶A脱氢酶是一类氧化还原酶，在线粒体脂肪酸氧化过程中，该酶不但有促进脂肪氧化作用，而且还涉及脂肪氧化中能量的产生。当家蚕被BmCPV感染后，家蚕体内免疫机制启动，Bm3HAD表达量出现上调趋势，随着病情的进展，其表达水平逐渐降低，脂肪酸氧化过程受到损害，最后Bm3HAD表达活性表现显著下调趋势，导致家蚕代谢失调，发生一系列生理和病理变化。关于Bm3HAD与家蚕对BmCPV感染应答反应有关的功能还有待于今后进一步的研究。

3材料与方法
3.1材料及主要试剂
供试家蚕品种 P50由中国农业科学院国家蚕种质资源保存中心馈赠。BmCPV多角体悬浮液(浓度为1×10⁹ /mL)由中国农业科学院蚕业研究所家蚕病理研究室保存。主要试剂：Trizol Reagent购自Invitrogen公司，PrimeScript^TM  RT reagent kit、SYBR premix Ex Taq^TM kit购自TaKaRa公司，SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 PCR Kit购自Clontech公司，pGEM-T Easy 载体购自Promega公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司。

3.2 BmCPV病毒接种
家蚕P50在标准温度和光照条件下饲养至五龄起蚕。将200头P50家蚕分为2组各100头，一组经口添食接种BmCPV作为试验组，另一组添食灭菌水作为对照组。将BmCPV多角体悬浮液用灭菌水稀释至多角体浓度1×10⁸/mL，取多角体稀释液100 μL均匀涂布在大小约15 cm² (3 cm×5 cm)的桑叶片上，将40片涂布病毒液的桑叶喂饲试验组5龄起蚕，待添毒叶食尽后改饲正常叶，折合每头蚕约食下4×10⁶个病毒多角体。对照组5龄起蚕以涂抹同样体积灭菌水的桑叶饲喂。

3.3家蚕组织器官材料的收集
分别于接种BmCPV后24 h、48 h和72 h，将感染BmCPV组和对照组家蚕幼虫在冰上解剖，分别收集血淋巴、中肠、脂肪体、生殖体以及丝腺。血淋巴样品立即加入到适量的Trizol中，其它组织则用生理盐水(RNAse-free水配制)漂洗，用滤纸吸除水滴后迅速投入到液氮中冰冻，然后放入-70℃冰箱保存备用。

3.4家蚕各组织器官总RNA提取
按照Trizol试剂盒说明书步骤，分别用Trizol试剂提取感染BmCPV组和对照组家蚕的生殖体、血淋巴、丝腺、脂肪体及中肠组织总RNA。用分光光度计检测各种组织样品总RNA浓度和纯度，最后放入-70℃保存备用。

3.5扩增引物设计
根据本实验室基因芯片实验筛选获得的Bm3HAD基因EST序列为模板，利用Primer Premier 5.0 软件设计目的基因PCR特异性引物。5’ RACE引物序列为 5’-AGCCCATTAGACCACCTCCAATAACC-3’，3’ RACE引物序列5’-CTCAGCAGGGTCGCAAAGAAGATGTA-3’。荧光定量PCR正向引物序列为5’- AGGTGGTCTAATGGGCTCCG-3’，反向引物序列为5’-GGTTTGTGCCAATGCTCTTC-3’；内参照β-actin基因的正向引物序列为5’-AATGGCTCCGGTATGTGC-3’，反向引物序列为5’-TTGCTCTGTGCCTCGTCT-3’。

3.6 Bm3HAD基因的5’端与3’端RACE扩增及产物纯化
按照SMART^TM RACE cDNA Amplification kit试剂盒说明书，以1 μg家蚕中肠组织RNA为模板反转录cDNA第一链。用Tricine-EDTA 缓冲液稀释合成的cDNA第一链，按照SMART^TM RACE Advantage cDNA PCR试剂盒说明书，扩增Bm3HAD基因的5’端与3’端序列。5’端RACE反应体系(25 μL)：5’端cDNA模板1.25 μL，dNTP Mix 0.5 μL，50×Advantage 2 polymerase Mix 0.5 μL，5’端特异性引物0.5 μL, 10×advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL，PCR-Grade water 17.25 μL，UPM (10×) 2.5 μL。3’端RACE体系(25 μL)：3’端cDNA模板1.25 μL、3’端特异性引物0.5 μL，其余组分与5’端RACE体系同。PCR反应程序：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s, 72℃延伸10 min，30个循环。取10 μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测目的条带。按照胶回收试剂盒说明书步骤回收目的条带，与pGEM–T Easy载体连接，并转化DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选，挑取有插入片断的阳性克隆进行测序。

3.7 Bm3HAD的生物信息学分析
克隆获得的cDNA片段经测序后，利用NCBI上的在线软件Vecscreen (screen sequence for vector contamination)去除载体序列。用Blastx和Blastn (NCBI, http://www.ncbi.nlm.gov/)进行同源性搜索，利用DNAMAN拼接软件将获得的5’端序列、3’端序列及该基因的EST序列拼接成Bm3HAD基因的全长cDNA序列。利用Blastn将Bm3HAD基因的全长cDNA序列与家蚕基因组比对，获得该基因全长cDNA所在家蚕基因组序列的登录号为：BABH01027674.1，分析基因序列结构；采用ExPASY (expert protein analysis system)的ProtParam软件预测该基因编码蛋白质的一级结构。

3.8 Bm3HAD基因的组织表达分析
利用Primer script^TM RT reagent试剂盒，按照说明书步骤反转录家蚕各组织cDNA，以反转录获得的各组织cDNA为模板进行RT-PCR分析。按照SYBR premix Ex Taq^TM试剂盒说明书进行荧光定量PCR。荧光定量PCR反应体系(20 μL)：10.0 μmol/L正、反向引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq^TM 10 μL，ddH₂O 8.2 μL。反应程序为：95℃ 10 s；95℃ 7 s，60℃ 20 s, 共40个循环。每个定量反应重复3次。用相对定量法，以β-actin为内标基因，以Ct值衡量Bm3HAD基因和β-actin基因在每个样品的表达水平，ΔCt作为计算Bm3HAD基因相对于β-actin基因的差异表达水平，用2^－⊿⊿Ct公式计算Bm3HAD基因的相对表达量，分析Bm3HAD基因在病毒感染蚕和和正常蚕各组织中的相对转录水平(Livak and Schmittgen, 2001)。

作者贡献
本论文署名作者中王秀负责该论文实验的设计、操作及文章的撰写；吴萍负责前期的基因芯片检测、提供本文所研究基因的EST序列并指导实验的设计；高坤、覃光星和刘挺负责试验中的病毒保存、接种及家蚕饲养；郭锡杰为本论文的通讯作者，全权负责本论文实验设计、实验过程及文章撰写的指导。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(No.30972143)和江苏省自然科学基金项目（BK2010353）资助。感谢两位匿名评审人对本文提出的评审意见。
 
参考文献
 Carpenter K., Pollitt R.J., and Middleton B., 1992, Human liver long-chain 3-hydroxyacyl-coenzyme Adehydrogenase is a multifunctional membrane-bound beta-oxidation enzyme of mitochondria, Biochem Biophys Res Commun, 183(2): 443-448
http://dx.doi.org/10.1016/0006-291X(92)90501-B

den Boer M.E., Wanders R.J., Morris A.A., IJlst L., Heymans S.A., and Wijburg F.A., 2002, Long-Chain 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency: clinical presentation and follow-up of 50 patients, Pediatrics, 109(1): 99-104
http://dx.doi.org/10.1542/peds.109.1.99 PMid:11773547

Eaton S., Chatziandreou I., Krywawych Pen S., Clayton P.T., and Hussain K., 2003, Short-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency associated with hyperinsulinism: a novel glucose-fatty acid cycle, Biochemical Society, 31(Pt 6): 1137-1139 http://dx.doi.org/10.1042/BST0311137 PMid:14641012

IJlst L., Oostheim W., Ruiter J.P., and Wangers R.J., 1997, Molecular basis of long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency: Identification of two new mutations, SSIEM and Kluwer Academic Publishers, 20(3): 420-422

IJlist L., Wanders R.J., Ushikubo S., Kamijo T., and Hashimoto T., 1994, Molecular basis of long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency: identification of the major disease-causing mutation in the a-subunit of the mitochondrial trifunctional protein, Biochim Biophys Acta., 1215(3): 347-350 PMid:7811722

Ikeda K., Nagaoka S., Winkler S., Kotani K., Yagi H., Nakanishi K., Miyajima S., Kobayashi J., and Mori H., 2001, Molecular characterization of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus genome segment 4, Journal of Virology, 75(2): 988-995
http://dx.doi.org/10.1128/JVI.75.2.988-995.2001 PMid:11134312 PMCid:113995

Livak K.J., and Schmittgen T.D., 2001, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method, Methods, 25(4): 402-408http://dx.doi.org/10.1006/meth.2001.1262 PMid:11846609

Molven A., Matre G.E., Duran M., Wanders R.J., Rishaug U., Njolstad P.R., Jellum E., and Sovik O., 2004, Familial Hyperinsulinemic hypoglycemia caused by a defect in the SCHAD enzyme of mitochondrial fatty acid oxidation, DIABETES, 53(1): 221-227 http://dx.doi.org/10.2337/diabetes.53.1.221

Qanungo K.R., Kundu S.C., Mullins J.I., and Ghosh A.K., 2002, Molecular cloning and characterization of Antheraea mylitta cytoplasmic polyhedrosis virus genome segment 9, Journal of General Virology, 83(Pt 6): 1483-1491 PMid:12029164

Sun Y.K., Wu A.Z., Dai R.M., and Shen X.R., 1982, Synthesis of structural proteins in a cell free system directed by silkworm cytoplasmic polyhedrosis virus mRNA synthesized in vitro, Scientia Sinica, (5): 684-690

Uchida Y., Izai K., Orii T., and Hashimoto T., 1992, Novel fatty acid b-oxidation enzymes in rat liver mitochondria II. Purification and properties of enoyl-coenzyme A (CoA) hydratase/3-hydroxy-acyl-CoA dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA thiolase trifunctional protein, Journal of Biological Chemistry, 267(2): 1034-1041  PMid:1730633

Wanders R.J., IJlst L., Gennip van A.H., Jakobs C., Jager de J.P., Dorland L., Sprang van F.J., and Duran M., 1990, Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency: identification of a new inborn error of mitochondrial fatty acidß-oxidation, Journal of Inherited Metabolic Disease, 13(3): 311-314   http://dx.doi.org/10.1007/BF01799383   PMid:2122092

Watanabe H., 2002, Genetic resistance of the silkworm, Bombyx mori to viral diseases, Current Science, 83: 439-446

Wu P., Wang X., Qin G.X., Liu T., Jiang Y.F., Li M.W., and Guo X.J., 2011, Microarray analysis of gene expression profile in the midgut of silkworm infected with cytoplasmic polyhedrosis virus, Molecular Biology Reports, 38(1): 333-341
http://dx.doi.org/10.1007/s11033-010-0112-4   PMid:20349281