神秘果(Synsepalum dulcificum)属于山榄科神秘果属，原产西非，自20世纪60年代引入中国，在海南、广东、广西等省区种植。神秘果果肉中含有一种特异的糖蛋白——神秘果素(miraculin)，能够改变人的味觉，食用酸味食物但感觉是甜味。近年来，科学工作者开始对其作用机理进行研究。

分子生物学研究中，基因的克隆、Northern杂交、cNDA文库构建等实验都以获得高质量RNA为基础，而从果实中提取高质量的RNA往往十分困难。神秘果素只在果实中表达(Hiwasa-Tanase et al., 2012)，而神秘果果实中含有丰富的酚类物质、色素及多糖，这些物质往往对RNA的提取有很大的影响。本试验以神秘果成熟果实为材料，参考TRIzol试剂法与CTAB提取法并加以改进，以探索出一个快捷有效并能满足分子生物研究的总RNA提取方法，为对神秘果素的进一步研究提供参考。

1结果与分析

1.1 RNA样品浓度与纯度分析

采用4种方法提取神秘果果肉总RNA，所得样品在220~320 nm紫外波长范围内进行扫描以检测其浓度与纯度(图1; 表1)。

图 1 220~320 nm紫外波长范围内总RNA样品扫描曲线 注: Ⅰ-TRIzol提取法; Ⅱ-TRIzol改良法; Ⅲ-CTAB粗提法; Ⅳ-CTAB精提法

表 1 不同方法提取神秘果果实总RNA的浓度和吸光度比值

由图1与表1可看出，TRIzol提取法及其改良法提取得到的RNA样品质量低，OD260/OD280均小于1.2，远远达不到1.8~2.0的标准，而且浓度很低，小于40 μg/mL，另外OD230值相对很高，表示多糖等杂质含量相对较多。而CTAB法得到的RNA样品质量较好，其中粗提法的总RNA浓度为192.5 μg/mL，OD260/OD280为1.93， OD260/OD230为2.51，表示总RNA样品纯度高，但有部分被降解；精提法的总RNA浓度为304.5 μg/mL，OD260/OD280为1.94，纯度高，OD260/OD230为2.12，表示总RNA样品纯度高，降解度小。

1.2 RNA完整性分析

为了检测提取所得的总RNA完整性，进行了变性琼脂糖凝胶电泳，结果如下图：

图 2 神秘果果肉总RNA电泳图 注: Ⅰ-TRIzol提取法; Ⅱ-TRIzol改良法; Ⅲ - CTAB粗提法; Ⅳ-CTAB精提法

由图2可知，TRIzol提取法与TRIzol改良法所得的RNA样品没有明显带条，表示含量非常低，可能是提取过程中无法有效防止酚类物质的氧化，导致此氧化物结合上RNA从而形成沉淀被除去。CTAB法的RNA样品带条明显，并且无DNA污染，其中精提法的28S rRNA 带条亮度是18S rRNA的2倍，说明总RNA完整性好。

1.3 RT-PCR验证

为了检测总RNA能否满足分子生物学实验，我们进行了RT-PCR验证实验。神秘果素存在于果肉中，在果实成熟的过程中大量表达，我们根据其序列设计引物进行RT-PCR反应，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。

图 3 神秘果素基因片段RT-PCR产物电泳图 注: M: Marker DS2000; Ⅰ-TRIzol提取法; Ⅱ-TRIzol改良法; Ⅲ - CTAB粗提法; Ⅳ-CTAB精提法

由上图可知，TRIzol提取法与TRIzol改良法得到的总RNA均得不到RT-PCR产物，因此不适合用于神秘果果实总RNA的提取。CTAB粗提法与CTAB精提法均得到RT-PCR产物，并且产物分子量正确，约670 bp。由此可得出，CTAB法适合神秘果果实总RNA的提取，能满足分子生物学实验的要求，并且CTAB粗提法所需时间约4 h，方便快捷。

2讨论

得到高质量的RNA是进行分子生物学研究的最基础的一步，不同的组织往往需要不同的提取方法。对于植物果实总RNA的提取，影响RNA质量最大的因素是多糖与酚类物质。多糖的性质与RNA相似，在提取过程中易与RNA一起沉淀，在后继实验中易与酶结合使酶失活，严重干扰实验的进行；而酚类物质在细胞破碎时被释放出来且易被氧化，此氧化物易与RNA不可逆地结合而形成不溶物，使RNA丧失生物活性(李宏, 1999)。因此，怎样有效去除多糖与酚类物质显得十分重要。

在现有的总RNA提取方法当中，TRIzol提取法是非常简捷的方法，操作简单且快速，但本实验证明，TRIzol法并不适合神秘果果实RNA的提取，就算在TRIzol改良法中针对性地加入2步，丙酮去除色素类与乙二醇丁醚去除多糖类，但提取产物中总RNA含量非常低，得不到RT-PCR产物。

CTAB法能有效的提取神秘果果实总RNA。提取液中加入高浓度(2%)的β-巯基乙醇可有效防止多酚类物质被氧化，PVP能有效结合酚类从而除去；LiCl能有效地沉淀RNA而使多糖留在上清液从而去除多糖。经过粗提法得到的总RNA已可满足RT-PCR反应，所用时间约为4 h，且操作方便快捷。在CTAB精提法中，用KAc沉淀多糖，使RNA留在上清而进一步除去多糖，得到较纯的RNA样品。

另外本实验还发现，RNA沉淀步骤中，-20℃沉淀过夜的效果优于-70℃沉淀1~2 h，可能是温度太低使得某些物质形成沉淀从而影响RNA的质量。

3材料与方法

3.1材料

试验材料为神秘果成熟果实，采收后液氨速冻，于-70℃贮藏备用。

3.2主要试剂

CTAB提取液：30 g/L CTAB，20 g/L PVP-40，0.5 g/L亚精胺，0.02 mol/L EDTA，0.1 mol/L Tris，2 mol/L NaCl，用盐酸调至Ph 8.0。

配制10 mol/L LiCl，2 mol/L LiCl，10 mmol/L Tris-HCl (Ph 7.5)，3 mol/L KAc (pH 5.5)。另外，TRIzol试剂、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、DEPC处理水备用。吸咀及塑料离心管用0.1% DEPC水处理12 h后高压灭菌，烘干备用。

3.3总RNA提取

方法一：TRIzol提取法，0.2 g材料用1 mL TRIzol提取液按照操作说明书进行提取。

方法二：TRIzol改良法(周波等, 2004)。在加入提取液TRIzol试剂前，0.2 g材料先用1 mL丙醇、20 μL β-巯基乙醇在室温下处理20 min，4℃ 8 000 r/min离心10 min，去上清。另外在加入异丙醇沉淀RNA前，加入1/2体积的乙二醇丁醚，冰上放置30 min，4℃ 8 000 r/min离心10 min，取上清。其它步骤按操作说明书进行。

方法三：CTAB粗提法(何健行等, 2010; 裴嘉博等, 2012; 张玲等, 2012)：材料去核，液氮快速研磨成粉末，取0.2 g材料于2 mL塑料离心管中，加入1 mL CTAB提取液和20 μL β-巯基乙醇，充分混匀，65℃处理30 min，15℃ 8 000 r/min离心10 min，取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，4℃ 12 000r/min离心10 min，取上清，加入1/3体积10 mol/L LiCl，混匀后于-70℃沉淀RNA 1~2 h(或-20℃沉淀过夜)，4℃ 13 000 r/min离心15 min，吸去上清，沉淀用200 μL 2 mol/L LiCl悬浮，4℃ 13 000 r/min离心5 min，沉淀用75%乙醇洗涤2次，4℃ 13 000 r/min离心5 min，小心吸去上清，沉淀在超净工作台中吹干，最后用20 μL DEPC水溶解RNA，-70℃保存备用。

方法四：CTAB精提法(何健行等, 2010; 裴嘉博等, 2012; 张玲等, 2012)：方法三得到的RNA沉淀用200 μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)溶解，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，冰上放置10 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，加入1/10体积3 mol/L KAc (pH 5.5)，冰浴30 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清，加入2倍体积的-20℃预冷无水乙醇，混匀后于-70℃沉淀RNA 1~2 h (或-20℃沉淀过夜)，4℃ 13 000 r/min离心15 min，RNA沉淀用75%乙醇洗涤2次，4℃ 13 000 r/min离心5 min，小心吸去上清，RNA沉淀在超净工作台中吹干，最后用20 μL DEPC水溶解，-70℃保存备用。

3.4 RNA检测

浓度测定：总RNA样品用紫外分光光度计在220~320 nm波长范围进行扫描，检测其浓度与纯度。

电泳检测：总RNA样品用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性。

3.5 RT-PCR验证

以Oligo(dT)为引物，1 μg总RNA，用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase XL (AMV)反转录酶进行反转录，得到cDNA第一链。根据神秘果素序列(GenBank accession number AB512278)设计引物(上游引物FP: 5’-CTCTGCATTGTTGGCAGCAG-3’; 下游引物RP: 5’- GGAGCTGATCATACATGAGATG-3’)进行PCR反应，反应体系为：1 μg DNA模板，各1 μL FP/RP (10 mmol/L)，2 μL dNTP mix (2.5 mmol/L)，2.5 μL 10×Buffer，1U KOD-Plus，ddH2O 补充至总体积25 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸1 min，35个循环；68℃终延伸10 min。扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

作者贡献

谭才邓主要负责实验的完成及论文写作；李静和邓毛程参与部分实验并提出部分建议。

致谢

本研究获得广东高校特色调味品工程技术开发中心开放课题项目(编号: GCZX-B1103)资助。

参考文献 

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