石斛兰是兰科石斛属(Dendrobium )多年生草本植物，与卡特兰、文心兰、蝴蝶兰并称四大观赏兰花。依开花时间可以把石斛兰分为春石斛秋石斛，春石斛于春季开花，花生于假鳞茎节上，每节开花3~4朵，花期3~4周，主要用作盆花观赏。秋石斛一般于秋季开花，花多生于茎顶端，花期长达一个多月，不仅是兰科中重要的切花种类，也是重要的观赏盆花，在兰花的商业生产中具有重要的地位。但是目前栽培的商业品种多为杂交一代，通过种子繁殖无法得到与亲代性状一致的植株。而通过分株繁殖不仅速度慢，而且易导致病毒的积累和传播，造成观赏品质的下降。因此，组织培养是提高秋石斛种苗繁育效率的有效途径。而外植体消毒是组织培养繁殖方式最重要的环节之一，秋石斛的外植体一般是取自基部萌发的侧芽或高位芽，但是两种部位的芽由于特性不一样，消毒起来均比较困难，基部萌发的侧芽数量较多，较容易采集，且比较粗壮，消毒不易致死，但由于植株基部靠近栽培基质，细菌较多，内生菌的污染比较严重，消毒比较困难；而高位芽不易受内生菌感染，但较瘦弱，消毒容易致死。因此秋石斛消毒是限制其组织培养的重要因素，直接影响了秋石斛组织培养的效率。针对这些问题，本研究开展了2%次氯酸钠+0.1%升汞(2% NaClO+0.1% HgCl2)不同消毒时间组合对秋石斛基部萌发侧芽的消毒研究，探索适合秋石斛侧芽的消毒方式，为提高秋石斛的组织培养效率提供技术保证。

1结果与分析

1.1 2% NaClO对秋石斛侧芽的消毒效果

由表1看出，2% NaClO对秋石斛侧芽茎尖的消毒效果较差，污染率虽随着消毒时间的增加而降低，但在30 min时，仍有62.22%的污染率，存活率随着消毒时间的延长而逐渐升高，在30 min时达到最高，但仅有23.33%。2% NaClO对秋石斛侧芽中部茎段的消毒在5 min和10 min时全部污染，在15~30 min时，随着时间的延长，污染率逐渐下降，30 min的污染率为76.67%，2% NaClO对外植体伤害较小，在消毒5~20 min时未有外植体死亡，25 min和30 min的死亡率分别是4.44%和11.11%，因此，虽然消毒20 min污染率较高，但由于无外植体死亡，因此存活率最高，为16.67%。2% NaClO对侧芽基部茎段消毒效果很差，消毒30 min的污染率高达78.89%，而存活率最高仅为16.67%。综合以上结果发现，虽然外植体死亡率较低，但是污染率高，外植体存活率低，因此2% NaClO不适合秋石斛侧芽外植体的消毒。

1.2 0.1% HgCl2对秋石斛侧芽消毒的影响

由表2看出，0.1% HgCl2对秋石斛侧芽3个部位外植体进行消毒，其污染率随着消毒时间的延长而逐渐下降，而死亡率均随着消毒时间的延长而逐渐上升，外植体的存活率则呈现先上升后下降的趋势。

侧芽茎尖在消毒14 min时，污染率由2 min的85.56%降到了0%，但死亡率也由0%上升到了64.44%，在16 min时，死亡率达到了81.11%。在2 min时，侧芽茎尖存活率为14.44%，之后随着消毒时间的增加而逐渐上升，在8 min时达到最高的61.11%，之后随着时间的增加逐渐下降，在16 min时仅有不足20% (18.89%)。侧芽中部、基部茎段在污染率、死亡率和存活率上和侧芽茎尖随消毒时间的变化趋势是一致的，不同的是，侧芽中部和基部茎段在消毒16 min时仍有少量的污染(污染率分别是5.56%和12.22%)，且死亡率均比相同消毒时间的侧芽茎尖要低。在存活率上，侧芽中部茎段在10 min时达到最高的57.78%，而侧芽基部茎段则在12 min时达到最高(51.11%)。

1.3 2% NaClO+0.1% HgCl2组合对秋石斛侧芽的消毒效果

1.3.1 2% NaClO +0.1% HgCl2组合对秋石斛侧芽茎尖的消毒效果

由表3看出，2% NaClO+0.1% HgCl2组合对秋石斛侧芽茎尖进行消毒，污染率随着消毒时间的增加而逐渐下降，死亡率则明显上升，存活率在2% NaClO消毒20 min以前，随着0.1% HgCl2消毒时间的增加呈现先升后降的趋势，在2% NaClO消毒25 min和30 min时则随着0.1% HgCl2消毒时间的增加而逐渐下降。在2% NaClO+0.1% HgCl2组合消毒为(5+6) min和(10+6) min时，污染率和死亡率分别为18.89%、14.44%和12.22%、18.89%，均较低，存活率分别达到66.67%和68.89%，因此这两个组合适合秋石斛侧芽茎尖消毒。

1.3.2 2% NaClO+0.1% HgCl2组合对秋石斛侧芽中部茎段的消毒效果

从表4看出，2% NaClO+0.1% HgCl2组合对秋石斛侧芽中部茎段进行消毒，污染率随着消毒时间的延长逐渐下降， 2% NaClO消毒15 min、20 min、25 min和30 min时，污染率分别在0.1% HgCl2消毒10 min、8 min、6和6 min时降到0%。外植体死亡率则逐渐上升，2% NaClO 消毒30 min+0.1% HgCl2消毒12 min时，死亡率达到100%。2% NaClO消毒5 min、10 min和15 min时，外植体存活率随着0.1% HgCl2消毒时间的延长先上升，在8 min达到最大值，分别为60.00%、64.44%和61.11%，之后逐渐下降。2% NaClO消毒20 min时，外植体存活率亦随0.1% HgCl2消毒时间的延长先上升，但在4 min时就达到最大值55.56%，之后逐渐下降。2% NaClO 消毒25 min和30 min时，存活率随0.1% HgCl2消毒时间的延长逐渐下降，0.1% HgCl2消毒12 min时，存活率分别为3.33%和0%。因此，2% NaClO 10 min+0.1% HgCl2 8 min适合于秋石斛侧芽中部茎段的消毒。

1.3.3 2% NaClO+0.1% HgCl2组合对秋石斛侧芽基部茎段的消毒效果

从表5看出，2% NaClO+0.1% HgCl2组合对秋石斛侧芽基部茎段进行消毒，污染率随着消毒时间的延长逐渐下降，在2% NaClO消毒15 min、20 min、25 min和30 min时，污染率分别在0.1% HgCl2消毒12 min、8 min、6和6 min时降到0%。外植体死亡率在各个2% NaClO消毒时间下均随着0.1% HgCl2消毒时间的延长而逐渐上升。而存活率与侧芽中部茎段的变化趋势相似，在2% NaClO 10 min+0.1% HgCl2 10 min时获得最高的存活率，达到67.78%。

2讨论

植物组织培养过程中，无菌体系的建立是组织培养的关键，而采自大田的实验材料极易粘附细菌和真菌等，建立无菌体系时不易消毒，因此，必须根据材料幼嫩程度、材料类型等来决定消毒方式和消毒时间(Leifert et al., 1994)。秋石斛生长属热带地区植物，常年高温多雨，空气湿度大，在茎叶表面滋生大量的微生物，并附着大量的霉菌袍子和细菌芽饱，甚至一些菌丝体浸入表皮内的薄壁组织形成大量的内生菌，给外植体消毒造成很大的困难(陈少珍等, 2006)。本研究首次将秋石斛新生侧芽按照幼嫩程度分为茎尖、中部茎段和基部茎段3个部分来展开消毒试验，结果表明秋石斛新生侧芽茎尖、中部茎段和基部茎段虽然来自同一个侧芽，但是由于幼嫩程度不一样，能承受的消毒剂伤害和携带的内生菌程度不一样，因此同一种消毒剂的最佳消毒时间也明显不一样。刘海龙等(2010)在研究油茶茎段的灭菌方法时，无木质化、木质化带腋芽茎段以及不带腋芽新萌条幼嫩顶梢和顶梢下部无木质化茎段的0.1% HgCl2最佳消毒时间也是不一样的。周婧等(2011)在研究红腺忍冬外植体灭菌时发现木质化程度不同的带腋芽茎段在0.1% HgCl2灭菌14 min时平均污染率、平均死亡率和芽平均诱导率均有明显差异。

不同的消毒剂对外植体的灭菌效果和伤害程度是不同的，HgCl2虽然对外植体的伤害较大，但是灭菌效果明显优于NaClO，如胡琦敏等(2013)在研究马槟榔组培快繁技术时发现，0.1%升汞对马槟榔外植体灭菌效果比10%次氯酸钠更理想；汪腾越等(2012)在进行土沉香组织培养外植体消毒方法的研究时发现，0.1% HgCl2比10% NaClO消毒效果好；李瑞梅等(2009)研究热带作物木薯幼嫩茎段的消毒方法时表明0.1% HgCl2的消毒效果优于10% NaClO。本研究表明，2% NaClO消毒的污染率高，而0.1% HgCl2虽然对外植体的伤害较大，但是在合适的消毒时间范围内可以获得较高的外植体成活率，与前面的研究结果相一致。

针对消毒困难的外植体，单独使用一种消毒剂消毒，污染率比较高，达不到理想的消毒效果。而多种消毒剂的配合使用已经在多种植物外植体的消毒实验中获得成功，如姚娜和赖志强(2010)在研究象草腋芽的外植体消毒中发现象草腋芽外植体最佳消毒措施为：自来水冲洗60 min+0.1% HgCl2消毒25 min+2% NaClO消毒20 min，该措施的污染率最低且成功率最高；蔡坤秀等(2010)在进行叶底红叶片外植体消毒方法的筛选的时候发现最佳灭菌措施为：自来水冲洗60 min+0.1%升汞浸泡25 min+次氯酸钠20 min；韩佳宇等(2012)对石栗树腋芽外植体消毒的研究表明最佳消毒组合为：自来水冲洗120 min+0.1% HgCl2消毒16 min +10% NaClO消毒24 min，这种消毒组合的污染率降到最低的16.67%，而愈伤组织诱导成功率却高达80.00%；陶兴魁等(2013)在研究蓝莓外植体消毒方法时发现，外植体经70%酒精30 s+2% NAClO 10 min+0.1% HgCl2 10 min的污染率最低，成活率最高。以上组合方法的使用虽然取得了很好的研究结果，但是由于设计的消毒时间梯度比较少，时间间隔比较大，不能准确的体现最佳的效果组合，本研究参考以上研究，将消毒时间梯度增加，缩短消毒时间间隔，展开2% NaClO+0.1% HgCl2对秋石斛侧芽茎尖、中部茎段和基部茎段的消毒效果。研究结果表明：(1) 2% NaClO浸泡10 min+0.1% HgCl2浸泡6 min对侧芽茎尖的消毒效果最好，污染率仅为12.22%，而存活率达到68.89%；(2) 2% NaClO浸泡10 min+0.1% HgCl2浸泡8 min对侧芽中部茎段的消毒效果最好，污染率仅为14.44%，而存活率达到64.44%；(3) 2% NaClO浸泡10 min +0.1% HgCl2溶液浸泡10 min对侧芽基部茎段的消毒效果最好，污染率仅为17.78%，而存活率达到67.78%。研究结果表明2% NaClO+0.1% HgCl2组合对秋石斛侧芽外植体的消毒效果比单独使用一种消毒剂消毒的好，但是幼嫩程度不同的外植体对2% NaClO+0.1% HgCl2消毒时间的承受范围不同。

本实验的研究结果为秋石斛无菌体系的建立提供了技术支持，为后续的秋石斛组培再生与种苗生产奠定了基础。

3材料与方法

3.1实验材料

实验材料为秋石斛‘088’新生侧芽，取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带花卉种质资源圃。选取生长粗壮，生长状态良好，具有6~7节的基部新生侧芽为实验材料。

3.2实验方法

3.2.1实验材料的预处理

选取生长粗壮，生长状态良好，具有6~7节的新生侧芽，用经酒精消毒的刀片切下，装入干净采样袋中带回实验室。将新芽的叶鞘小心剥掉，切成茎尖、中部3~4节茎段和基部2~3节茎段三部分，分别置于150 mL三角瓶中，用洗衣粉清洗干净之后流水冲洗30 min，倒掉水后于超净工作台进行消毒实验操作。

3.2.2外植体消毒方法

将预处理好的实验材料于超净台内用75%的酒精浸泡30 s，无菌水冲洗2次备用。

将材料分别按如下方案进行消毒处理，其中2% NaClO和0.1% HgCl2单独消毒按单因素试验设计，组合试验按双因素试验设计，具体如下：

(1) 2% NaClO消毒，时间设为0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min。

(2) 0.1% HgCl2消毒，时间设为0 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min、16 min。

(3) 2% NaClO+0.1% HgCl2消毒，2% NaClO时间设为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，0.1% HgCl2时间设为2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min，将2% NaClO消毒时间和0.1% HgCl2消毒时间进行正交设计，共计38个处理，每个处理的消毒顺序为先2% NaClO后0.1% HgCl2。

消毒之后用无菌水清洗6~7次，接种于培养基上，20 d之后统计污染、死亡和成活数量。   实验中，每个处理接种10瓶，每瓶3个外植体，每个处理3次重复。

3.3培养基的其它因素和培养条件

本实验中采用的培养基为MS培养基，附加3.5 g/L的琼脂为固化剂和30 g/L的蔗糖，PH值调至5~6之间。培养室温度控制在25℃左右，光照强度为3 000 lux，每天光照时间为16 h。

3.4数据统计

污染率=污染外植体数/接种外植体总数×100%。

死亡率=死亡外植体数/接种外植体总数×100%。

存活率=存活外植体数/接种外植总体数×100%。

作者贡献

本研究主要由陆顺教完成。易双双在后期的数据统计和分析上给予了很大帮助；任羽和冷青云对实验材料进行了充分准备和操作技术上进行了细心指导；尹俊梅和杨光穗从实验设计、论文构思到文章修改、审阅等环节给予了悉心指导。

致谢

本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630032013004)资助。同时感谢中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带花卉研究室全体同仁的大力支持。

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