刺五加[Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim) Maxim]是五加科的珍贵药用植物，化学成分分析的结果表明，三萜皂苷类化合物是其主要药用成分之一(涂正伟等, 2011)。在植物体内，三萜皂苷类化合物的生成过程中，鲨烯合酶(squalene synthase, SS)负责异戊二烯途径的第一步酶促反应，催化2分子的法呢酰基二磷酸缩合成为1分子鲨烯(Kim et al., 2011)。鲨烯环氧酶(squalene epoxidase, SE)负责随后的氧化反应，催化鲨烯氧化生成2,3-氧化鲨烯(Han et al., 2010)。β-香树酯醇合成酶(β- amyrin synthase, β-AS)负责催化2,3-氧化鲨烯环化形成β-香树酯醇，从而使2,3-氧化鲨烯进入三萜皂苷合成代谢支流(Wu et al., 2012; Jin et al., 2014)。三者同为三萜皂苷生物合成的关键酶。

内生菌广泛分布于药用植物体内，并可对宿主植物的药用成分含量产生重要的影响(马广强等, 2014)。菌株P116-a为分离自刺五加的内生青霉(Penicillium minioluteum)，回接该菌株后在显著提高刺五加皂苷含量的同时对宿主的正常生长发育也无不良影响(邢朝斌等, 2009)。Real-time PCR分析的结果表明，P116-1a菌株可显著改变刺五加SS、SE和β-AS基因的表达量，进而影响刺五加的皂苷含量(邢朝斌等, 2012)。但随后的研究发现，和其他物种相似，刺五加的SS、SE和β-AS基因均存在基因家族现象(邢朝斌等, 2014)。对拟南芥(Rasbery et al., 2007)，人参(Han et al., 2010)等物种关键酶基因家族的研究结果表明，基因家族的各成员虽然结构相似，但各自的时、空表达特点和催化效率等却各有不同。这说明基因家族的不同成员对药用植物的药用成分合成具有不同的贡献和不同的作用机理。

因此，本研究从基因家族全部成员的角度，分别分析SS、SE和β-AS基因家族的各成员在回接P116-1a后的表达情况，进而明确各成员对刺五加皂苷合成的影响，试图揭示内生菌提高药用植物药用成分含量的基因机制。

1结果与分析

1.1接种P116-1a对刺五加SS1、SS2表达的影响

对回接内生青霉菌株P116-1a后，刺五加SS1和SS2基因的表达量均发生显著改变(图1)。其中，SS1基因在回接P116-1a后显著降低(p<0.05)，最低表达量出现在回接60 d时，仅为对照组SS1表达量的19.7%。SS2基因在回接P116-1a菌株30 d时，显著提升至对照组的1.55倍(p<0.05)，之后开始下降，回接60 d时与对照组持平，之后降至显著低于对照组的表达水平(p<0.05)。

图 1 接种P116-1a对刺五加SS基因家族表达的影响

1.2接种P116-1a对刺五加SE1、SE2表达的影响

回接内生青霉P116-1a菌株后，刺五加SE基因家族的表达变化如图2所示。在回接菌株P116-1a的整个生长期间，SE1基因的表达水平被显著提高(p<0.05)，其中，回接30 d时的提升水平最大，达对照组的2.61倍，回接90 d时的提升水平最低，为对照的1.35倍，但回接60~120 d时，P116-1a对SE1的表达量提升水平差异不显著。与此不同，在回接P116-1a菌株60 d以内，SE2的表达被显著抑制(p<0.05)，其中，回接60 d时的表达量最低，仅为对照组的22.3%，之后回升至对照组SE2的表达水平。

图 2 接种P116-1a对刺五加SE基因家族表达的影响

1.3接种P116-1a对刺五加β-AS1、β-AS2表达的影响

回接内生青霉P116-1a菌株后，刺五加β-AS基因家族的表达变化如图3所示。回接60 d以内，宿主刺五加β-AS1基因的表达量显著升高，其中，最大值出现在回接60 d时，达对照的4.77倍。回接90 d时急速降低至对照的25.5%，回接120 d时回升至略高于对照组的表达水平，但两者差异不显著。在回接后的整个生长期内，P116-1a菌株显著提升了β-AS2基因的表达水平，与对照组相比，平均提升2.84倍。其中，回接90 d时的提升量最大，达对照的4.17倍，回接120 d时的提升量最小，为对照组β-AS2表达量的1.89倍。

图 3 接种P116-1a对刺五加β-AS基因家族表达的影响

1.4接种P116-1a对刺五加皂苷含量的影响

回接内生青霉P116-1a菌株后，刺五加皂苷的积累规律与对照组基本相符，但宿主刺五加的总皂苷含量均显著高于对照组的含量(p<0.05)，整个生长期间平均提高了3.31倍。其中，回接30 d时的提升水平最大，达对照组皂苷含量的4.38倍，回接120 d时的提升量最小，为对照组含量的1.65倍图4。

图 4 接种P116-1a对刺五加皂苷含量的影响

1.5关键酶基因家族表达和皂苷含量的相关性

相关性分析结果表明，回接菌株P116-1a后，刺五加的SS2、SE1和β-AS2的表达量显著提高，其提升量与皂苷含量的变化同升同降，相关系数分别为：0.917、0.814和0.878，存在显著的正相关关系(p<0.05)。而SS1、SE2和β-AS1的表达量与皂苷含量变化间的相关系数较低，分别为：-0.264、-0.371和0.671，未达显著水平。

2讨论

对药用植物内生真菌的研究表明，内生菌进入宿主体内后，将首先引起宿主抗逆和信号转导相关基因的表达变化，之后这些变化作用于宿主植物次生代谢有关的基因，改变其表达量后，才能最终引起药用植物有效成分含量的大量生产和积累(邢朝斌等, 2012; 马广强等, 2014)。

目前，刺五加的皂苷合成关键酶基因已陆续被克隆，并分析了P116-1a对刺五加关键酶基因表达的影响(邢朝斌等, 2012)。但随后的研究表明，包括刺五加在内的生物体中，催化三萜皂苷生物合成的SS、SE和β-AS均以2个或2个以上成员构成的基因家族的形式存在(Manfield et al., 2007; Uchida et al., 2009; 邢朝斌等, 2014)，但不同物种中其成员数量不同，且各成员的表达特性也存在差异(Han et al., 2010; 邢朝斌等, 2014)。

目前，此类研究主要集中于哺乳类动物，而对药用植物的相关研究较少(Manfield et al., 2007)。对人参SS基因家族的研究显示，人参具有PgSS1、PgSS2和PgSS3共3个成员，三者均具有相同的生物学功能，但PgSS1与管家基因类似，在所有组织中均稳定表达，而PgSS2主要在叶和根中高表达，PgSS3则在叶中高表达；

另外，虽然三者都能在茉莉酸甲酯处理后提升表达量，但PgSS2和PgSS3的提升量较小，未达显著水平，而PgSS1的提升量显著高于对照(Kim et al., 2011)。拟南芥的测序结果显示，其SE基因家族由6个成员构成，其中成员1~3编码有功能的鲨烯环氧酶，4~6无活性(Uchida et al., 2009)。而人参的SE有2个具有生物学功能的成员，茉莉酸甲酯仅提高了PgSE1的表达，而PgSE2的表达却受到了抑制(Han et al., 2010)。

在不考虑基因家族各成员的情况下，对各关键酶基因家族进行统一分析的结果表明，回接内生青霉P116-1a后，SS基因家族的整体表达量仅在回接早期显著提高。而随着回接时间的延长，SE基因家族的表达量逐渐上升，至回接120 d时显著高于对照，β-AS基因家族的整体表达量除回接的早期(30 d)外，均显著高于对照(邢朝斌等, 2012)。

本研究中，菌株P116-1a显著提升了刺五加SS2、SE1和β-AS2的表达量且与刺五加的皂苷含量呈显著的正相关关系。说明，上述3个基因是内生真菌P116-1a提高刺五加皂苷含量的主要作用靶点基因，这一结果与刺五加SS、SE和β-AS基因家族各成员对刺五加皂苷生物合成作用强度的分析结果相一致(邢朝斌等, 2014)。但与P116-1a对SS基因家族总体表达量改变较小的结果(邢朝斌等, 2012)显著不同。这主要是因为P116-1a在显著提高刺五加SS基因家族中SS2表达的同时，也显著抑制SS1的表达，即此消彼长的原因造成的。

3材料与方法

3.1试验材料

刺五加(Eleutherococcus senticosus)采自吉林省梅河口市。内生青霉菌株P116-1a由本实验室分离、鉴定和保藏。为了便于对结果进行比较，参照文献的方法(邢朝斌等, 2012)，分别在回接P116-1a菌株30 d、60 d、90 d和120 d后，取叶片作为提取RNA和测定皂苷含量的试材。

3.2 P116-1a的回接与鉴定

将冻存的内生青霉P116-1a菌种(Penicillium minioluteum)接种在马铃薯葡萄糖培养基上，28℃培养7 d后，收集活化的孢子与菌丝配成水悬液。参照文献(邢朝斌等, 2012)的方法进行培养，并进行回接与鉴定。

3.3 RNA的提取、反转录与引物

利用植物总RNA提取试剂盒(天根生物有限公司)和RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit (日本TaKaRa公司)分别提取对照及回接P116-1a菌株30 d、60 d、90 d和120 d后各样本的总RNA，并取1 μL总RNA反转录为cDNA。

根据刺五加SS基因家族的SS1成员(HQ456918)、SS2成员(JN714465)、SE基因家族的SE1成员(JF818129)、SE2成员(JN228206)、β-AS基因家族的β-AS1成员(JF818130)、β-AS2成员(JF818131)和内参照基因actin (KC469585)的cDNA全长序列，利用real-time PCR扩增引物设计的基本原则，分别设计各基因的扩增引物，并由生工生物(上海)公司进行合成。扩增SS1基因的引物对为5'- GAGATCCTGCTATCTTCCGGTTT-3'和5'-AGACCACGCCTCAGTTTCACTAC-3'，扩增长118 bp的片段；扩增SS2基因的引物对为5'-TCACGACTAGATGGACAAGCAAA-3'和5'- GCCAATAACAAGAGCAGGAATG-3'，扩增长143 bp的片段；扩增SE1基因的引物对为5'- TAAAGTCGGAAGGAGTTCG-3'和5'-CTTAGTGAATGAATGGGAGG-3'，扩增长82 bp的片段；扩增SE2基因的引物对为5'-TGACAAAGCAAGGCAAGAAATG-3'和5'-AGCGACAGCAAAGAAGTGGAG-3'，扩增长142 bp的片段；扩增β-AS1基因的引物对为5'-GCTCTGAAGACTACCATGAAACACA-3'和5'- ACCCAACAAGCAAGCATACAGA-3'，扩增长104 bp的片段；扩增β-AS2基因的引物对为5'- TTCCCGAATGCCAACAGAA-3'和5'-TCCCAAATAGCAAAACCACCA-3'，扩增长117 bp的片段；扩增actin基因的引物对为5'-GCAAGAGCTTGAAACAGCAAAG-3'和5'-TCAAAGATGGCTGGAAAAGGA-3'，扩增长128 bp的片段。

3.4 Real time PCR反应与皂苷含量分析

以3.3中各样本的cDNA为real time PCR反应的模板，分别利用SS1、SS2、SE1、SE2、β-AS1、β-AS2和actin基因的real time PCR扩增引物进行PCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测产物特异性后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生物有限公司)回收，获得各基因家族成员的高浓度产物。以此高浓度产物为标准品，进行级联的5次10倍稀释，制作标准曲线。按照SYBR® Premix Ex TaqTM II的说明，利用ABI 7900 HT real-time PCR system进行real time PCR反应。总反应体系中，各基因家族成员后内参基因的扩增引物各0.3 μL，50 ×ROX reverse 0.2 μL，各样本的cDNA原液或从琼脂糖凝胶中回收的DNA 0.3 μL， dd H2O 3.9 μL，SYBR® Premix Ex TaqTM II 5 μL，共10 μL。反应条件为：95℃ 1 m，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共进行40个Real-time PCR循环。Real-time PCR反应结束后，分析各基因扩增产物的溶解曲线，确定其产物的特异性。每个反应重复3次。根据各基因的标准曲线及其对应的Ct值，参照文献(邢朝斌等, 2012)的方法分别计算各基因家族成员的表达量。

参照文献(邢朝斌等, 2012)的方法测定各样本的总皂苷含量，并结合表达量分析的结果进行相关性分析。

作者贡献

龙月红负责Real-time PCR、引物的设计及皂苷含量的测定、实验数据分析与论文撰写；杨果和李非非参与了RNA提取、逆转录、回接菌株的实验并提出建议；邢朝斌负责论文的修改、实验的设计、指导；全体作者均已阅读并同意提交发表。

致谢

本研究由河北省自然科学基金-石药集团医药联合研究基金(H2012401006)、河北省教育厅资助科研项目(QN2014102)和河北联合大学培育基金(GP201306)共同资助。衷心感谢河北联合大学药学院的劳凤云教授、河北联合大学生命科学学院的吴鹏实验师及2011级生物技术专业修乐山同学在实验过程中给予的无私帮助。

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