研究报告/Research Report
刺五加HMGR基因的表达及其对皂苷合成的影响 
李非非 
,
杨果 ,
吴鹏 ,
邢朝斌 
,
杨果 ,
吴鹏 ,
邢朝斌
河北联合大学生命科学学院, 唐山, 063000
作者 通讯作者
植物药与药理学杂志, 2015 年, 第 4 卷, 第 4 篇 doi: 10.13417/j.gab.034.000560
收稿日期: 2015年03月28日 接受日期: 2015年03月30日 发表日期: 2015年03月07日
作者 通讯作者
植物药与药理学杂志, 2015 年, 第 4 卷, 第 4 篇 doi: 10.13417/j.gab.034.000560
收稿日期: 2015年03月28日 接受日期: 2015年03月30日 发表日期: 2015年03月07日
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推荐引用：
引用格式(中文)：
李非非等, 2015, 刺五加HMGR基因的表达及其对皂苷合成的影响, 植物药与药理学杂志(online) Vol.4 No.4 pp.1-5 (doi: 10.13417/j.gab.034.000560)
引用格式(英文)：
Li F.F. et al., 2015, Expression of 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl coenzyme A gene in Eleutherococcus senticosus and its influence on saponins synthesis, Zhiwuyao Yu Yaolixue Zazhi (online) Vol.4 No.4 pp.1-5 (doi: 10.13417/j.gab.034.000560)
摘要
以actin为内参基因，采用Real time PCR法分析产地、发育时期、器官以及茉莉酸甲酯(MeJA)对刺五加HMGR基因表达的影响，并采用分光光度法测定皂苷含量，利用SPSS 17.0软件分析两者的相关性。结果表明：HMGR基因在各器官中均有表达，相对表达量间差异较明显(p<0.05)。刺五加HMGR基因在盛花期表达量最大，叶片衰老期表达量最低。MeJA处理后显著提升了萌芽期至盛花期HMGR的表达量，而对果实快速生长期之后的影响较小。不同产地刺五加的HMGR基因表达量和总皂苷含量差异显著，而HMGR基因的表达量与总皂苷含量同升同降，存在极显著的正相关关系(p<0.01)。
关键词
刺五加；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A；表达；皂苷
刺五加(Eleutherococcus senticosus (Rupr.et Maxim) Maxim)同人参为五加科植物，是我国珍贵药材，具有益气健脾、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳等功效(涂正伟等, 2011)。目前，以刺五加为材料的中成药种类颇多，如刺五加注射液等；加之以刺五加为材料的中医处方需求量也较大，导致刺五加供不应求(赵敏等, 2001)。本从调控刺五加苷生物合成途径的关键酶表达入手，深入揭示刺五加的主要药用成分的生物合成机理，从而为获得大量的刺五加药用成分奠定基础。
萜类化合物在植物生命过程中起着重要作用，其基本结构单元是类异戊二烯(郝金凤等, 2010)。在高等植物中，类异戊二烯代谢至少存在2条途径，其一为丙酮酸/磷酸甘油醛途径，其二为以甲羟戊酸(MVA)为前体的甲羟戊酸途径(Lichtenthaler et al., 1997)，但三萜类化合物主要以甲羟戊酸途径合成(郝金凤等, 2010)。在三萜类化合物的MVA生物合成途径中，3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMGR, 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)是MVA中最先起作用的关键酶，是植物代谢过程中重要的调控位点(Aquil et al., 2009)。刺五加HMGR基因cDNA全长序列已被克隆(邢朝斌等, 2012)，但尚未有对刺五加HMGR基因的表达及其对皂苷合成的影响报道，因此本研究以actin为内参基因，利用Real time PCR技术，分析产地、生长发育时期、器官以及茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)对刺五加HMGR基因表达的影响及其与皂苷合成的相关关系，为通过基因工程手段提高刺五加中的三萜皂苷含量奠定基础。
1结果与分析
1.1 Real time PCR扩增效果的检测
刺五加的HMGR和actin基因在Real time PCR扩增前期，基线平整，扩增区和指数区明显，Ct值介于23~33之间，无引物二聚体或非特异性引物等引起的杂峰，为理想的扩增曲线。在扩增后期，溶解曲线中出现单一的特异峰，说明产物单一，扩增特异性好(图1)。
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图 1 HMGR和actin溶解曲线
Figure 1 Dissociation curve of HMGR and actin
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1.2 HMGR在不同产地刺五加中的表达
Real time PCR的结果显示，HMGR基因在不同产地刺五加中均有表达(图2)，但表达量间的差异极其明显(p<0.05)。7个产地刺五加的HMGR相对表达量由高到低依次为穆棱>鸡西>本溪>伊通>梅河口>珲春>雾灵山，其中最大表达量(穆棱)是最小表达量(雾灵山)的19.05倍。
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图 2 各产地来源刺五加的HMGR相对表达量
注: 不同小写字母表示差异显著, p<0.05, 下同
Figure 2 Relative expression of HMGR in different origin in E. Senticosus
Note: Different small letters represent significant difference, p<0.05, the same as blow
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1.3 HMGR在刺五加各生长发育时期的表达
在萌芽期(4月26日)至盛花期(6月26日)，刺五加HMGR的表达量显著升高，此后，直至叶片衰老期(9月26日)，又显著降低，且各期的表达量间存在显著性差异(p<0.05, 图3)，其中盛花期的表达量最高，叶片衰老期的表达量最低，两者相差13.4倍。
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图 3 图 3 HMGR在不同发育时期刺五加中相对表达量
Figure 3 Relative expression of HMGR in different growth periods in E. senticosus
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1.4 MeJA处理刺五加后HMGR的表达分析
MeJA处理后，自萌芽期到叶片衰老期HMGR基因相对表达量呈先升后降趋势(图4)。果实快速生长期(7月26日)、果实成熟期(8月26日)和叶片衰老期，MeJA处理与否差异不明显。在萌芽期、叶片完全展开期(5月26日)、盛花期，MeJA处理后HMGR基因的相对表达量显著提高。其提升的最大值出现在叶片完全展开期，两者相差176.3倍。
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图 4 MeJA处理刺五加后HMGR的相对表达量
Figure 4 The relative expression of HMGR treated by MeJA in E. Senticosus
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1.5 HMGR在刺五加不同器官中的表达
刺五加的叶片、叶柄、茎和根中均有HMGR的表达，但各器官中的表达量差异显著(p<0.05)。不同器官中刺五加HMGR基因的相对表达量由高到低依次为：叶柄＞叶片＞根＞茎，其中最大表达量(叶柄)是最低表达量(茎)的5.27倍(图5)。
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图 5 HMGR在刺五加不同器官中的相对表达量
Figure 5 In different organ of E. Senticosus the relative expression of HMGR
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1.6 HMGR基因表达对刺五加总皂苷含量的影响
所测不同产地刺五加样本的总皂苷含量依次为：穆棱(4.80 g/100 g)>鸡西(4.74 g/100 g)>本溪(3.25 g/100 g)>伊通(3.12 g/100 g)>珲春(2.40 g/100 g)>雾灵山(1.89 g/100 g)>梅河口(1.69 g/100 g)。其中皂苷含量最大值(穆棱)为最小值(梅河口)2.84倍。各产地刺五加的皂苷含量与其对应的HMGR基因表达量间同升同降，相关系数为r=0.941，SPSS 17.0软件分析的结果显示，两者具有极显著的正相关关系(P<0.01)。以X为刺五加HMGR的表达量，Y为刺五加的皂苷含量建立的两者间的回归方程为：Y=0.182 6X+1.680 1。
2讨论
调控萜类化合物生成、功能和结构的酶在生物合成途径中存在很多，但关键酶是决定下游萜类化合物的组成和含量的主导因子(Cao et al., 2010)。HMGR被认为是甲羟戊酸途径中第一个限速酶，是萜类化合物代谢活动中重要的调控位点，其决定“碳流”的方向(Aquil et al., 2009)。已在马铃薯中发现该基因的1个cDNA片段，命名为HMGR-c2，此基因在马铃薯的根、茎、叶中均表达，其叶片的表达量最高，根和茎次之(陈大华等, 2000)；刺五加的HMGR基因在根、幼茎、叶片和叶柄中也均有表达，其叶柄、叶片表达量较高，根和茎次之，与马铃薯HMGR-c2基因的表达特点基本相同。
一般认为，MeJA被植物吸收后，可提高特定功能基因的表达量，进而影响植物的代谢(Vom Endt et al, 2007)。如喷施MeJA后，可以激活稠李(Padus racemosa Gilib.)植物体内的三萜皂苷的关键酶——β-香树素合成酶基因。刺五加的实验结果与此相似，即，MeJA可显著提高刺五加HMGR基因表达量。所不同的是，MeJA处理后仅在处理前期(萌芽期, 叶片展开期, 盛花期)显著提高了HMGR的表达水平，而此后与对照组间差异不显著。
已有实验证实，番茄在早期的果实发育中HMGR表达量较高，在成熟期番茄的果实HMGR表达量性表达较低，而甜瓜果实的HMGR表达量与其大小密切相关(郝金凤等, 2010)。HMGR基因在不同生长发育时期中呈现“低-高-低-高”变化趋势，在盛花期HMGR表达量最高，但与刺五加总皂苷含量的变化趋势基本吻合(邢朝斌等, 2012)。同时，表达量分析和含量测定的结果表明，虽然两者在刺五加各样本间显著不同，但HMGR的表达量始终与对应样本的皂苷含量始终同升同降，具有极显著的正相关关系(p<0.01)，相关系数达r=0.941。这表明，HMGR是催化刺五加中皂苷生物合成的关键酶之一。
3材料与方法
3.1材料
为了便于对结果进行比较，参照文献(邢朝斌等, 2012; 修乐山等, 2014)中的材料，以采自穆棱、珲春、梅河口、伊通，本溪、鸡西和雾灵山的刺五加作为试材。分别于2013年4~9月的26日采集各样本的叶片，同时在7月26日收集伊通产地刺五加的根、茎和叶柄作为实验材料。
3.2 MeJA处理
自刺五加萌芽(4月15日)后，以产地穆棱的刺五加为试材，对全株的叶片喷施5 mmol/L MeJA，共计喷洒3次，间隔5 d，并以dd H2O进行平行处理，作为对照。
3.3 cDNA的获得与引物
根据已克隆的刺五加HMGR基因(GenBank登录号: JQ905593, 邢朝斌等, 2012)、actin基因(GenBank登录号: KC469585)的序列，设计特异性引物。扩增刺五加HMGR的上下游引物分别为5'- GGATTGAAGGGCGAGGAAA-3'、5'-GCAACAGCAGAACCAGCAAG-3'，扩增长度为136 bp。扩增刺五加actin基因的上下游引物分别为5'-GCAAGAGCTTGAAACAGCAAAG-3'、5'- TCAAAGATGGCTGGAAAAGGA-3'，预计扩增长度为128 bp (吴鹏等, 2014)。将 3' RACE 和 5' RACE 扩增产物测序后拼接获得完整的 SAD 基因序列，根据 NCBI 分析所得 ORF设计 SAD 基因全长引物(上游引物: 5'-ATGGGGATTGTTCAACTCACTTT-3'; 下游引物: 5'-TTAAAGCTGTACTTGTCTGTCGAAA-3')，以黄连木种子 c DNA 为模板进行 PCR 扩增。引物合成和测序分别由上海生工和金唯智生物科技(北京)有限公司完成。
3.4 Real time PCR与含量分析
以刺五加的cDNA为模板，分别利用HMGR和actin的特异性引物进行PCR扩增，回收、纯化后得到含高浓度HMGR和actin DNA的溶液。将其以1×、10×、100×、1 000×和10 000×共5个浓度进行稀释，用于标准曲线的制作。按照TaKaRa公司SYBR® Premix Ex Taq™ II的说明，利用ABI 7900 HT进行real time PCR反应，扩增各样本刺五加的HMGR和actin基因。反应体系共10 μL，其中cDNA模板为0.5 μL、上下游引物各0.2 μL、SYBR® Premix Ex Taq™ II 5 μL、ROX reference dye 0.2 μL、dd H2O 3.9 μL。反应条件为：94 ℃ 30 s，之后95 ℃ 5 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循环40次。参照文献的方法(吴鹏等, 2014; 修乐山等, 2014)，计算各样本刺五加中HMGR基因的相对表达量。
作者贡献
HMGR和actin基因的real time PCR和论文初稿主要由第一作者李非非完成；实验的总体设计与论文的修改由通讯作者邢朝斌负责；杨果和吴鹏参与了皂苷含量测定和数据分析的工作。
致谢
本研究由河北省大学生创新创业训练计划(201410081064)、河北联合大学大学生创新性实验计划(X2014036)、河北省自然科学基金-石药集团医药联合研究基金(H2012401006)、河北省教育厅资助科研项目(QN2014102)和河北联合大学培育基金(GP201306)共同资助。感谢河北联合大学生科院实验室的龙月红实验师及生物技术专业2014级尤鹏生和李志栋同学在实验过程中给予的无私帮助。
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植物药与药理学杂志
• 第 4 卷
