研究报告/Research Report
滇重楼茎叶总皂苷抗肝癌HepG2细胞活性 
许新恒1 
,
康梦瑶1 ,
匡坤燕1 ,
杜琳颖2 ,
韦蒙1 ,
李云坤1 ,
淦永鉴3 ,
曾宪垠1 ,
曹晓涵1 ,
孟风艳1 ,
杜小刚1 
,
康梦瑶1 ,
匡坤燕1 ,
杜琳颖2 ,
韦蒙1 ,
李云坤1 ,
淦永鉴3 ,
曾宪垠1 ,
曹晓涵1 ,
孟风艳1 ,
杜小刚1
1四川农业大学生命科学学院, 雅安, 625014
2四川农业大学理学院, 雅安, 625014
3泸州市产品质量监督检验所, 泸州, 646000
作者 通讯作者
植物药与药理学杂志, 2016 年, 第 5 卷, 第 3 篇
收稿日期: 2016年08月10日 接受日期: 2016年08月17日 发表日期: 2016年08月25日
2四川农业大学理学院, 雅安, 625014
3泸州市产品质量监督检验所, 泸州, 646000
作者 通讯作者
植物药与药理学杂志, 2016 年, 第 5 卷, 第 3 篇
收稿日期: 2016年08月10日 接受日期: 2016年08月17日 发表日期: 2016年08月25日
© 2016 BioPublisher 生命科学中文期刊出版平台
本文首次发表在 因组学与应用生物学》(2016年35卷第8期1865-1870页)上。现依据版权所有人授权的许可协议，采用 Creative Commons Attribution License,协议对其进行授权，再次发表与传播。只要对原作有恰当的引用, 版权所有人允许并同意第三方无条件的使用与传播。
推荐引用：
引用格式(中文)：
许新恒等, 2016, 滇重楼茎叶总皂苷抗肝癌HepG2细胞活性, 基因组学与应用生物学, 35 (8): 1865-1870 (doi: 10.13417/j.gab.035.001865)
引用格式(英文)：
Arvind et al., 2012, Anti-hepatoma Effects of the Total Saponins Extract from Stems and Leaves of Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz. on HepG2 cells, Genomics and Applied Biology, 35(8): 1865-1870 (doi: 10.13417/j.gab.035.001865)
摘要
探究滇重楼茎叶总皂苷对肝癌HepG2细胞增殖的抑制、细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡作用。从滇重楼地上茎叶提取总皂苷，配制成浓度为10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml和160 μg/ml的总皂苷提取物处理HepG2细胞。总皂苷提取物对细胞增殖的抑制作用采用MTT法检测；对细胞周期阻滞作用采用流式细胞术检测；诱导细胞凋亡的作用采用细胞核荧光染色、流式细胞术和caspase-3活性试剂盒检测。结果表明，滇重楼茎叶总皂苷提取物能显著抑制细胞增殖，且具有时间、剂量依赖效应，能阻滞细胞周期于S期，并能诱导细胞凋亡。但其诱导凋亡作用仅高剂量组(≥80 μg/ml)效果显著，低剂量组(＜80 μg/ml)不显著。
关键词
滇重楼； 茎叶总皂苷；细胞周期； 细胞凋亡； Caspase-3
滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz.)是多年生草本植物，以根茎入药，具有消肿止痛、清热解毒、凉肝定惊等功效，广泛应用于恶性淋巴瘤、肺癌、鼻咽癌、脑肿瘤等各种癌症的治疗，经济价值和药用价值极高(Pharmacopoeia Commission of the Ministry of Health of the P.R.C., 2010; 夏亚飞和阎姝, 2012)。甾体皂苷是滇重楼根茎的主要有效成分，皂苷类型主要分为薯蓣皂苷元的糖苷和偏诺皂苷元的糖苷(武珊珊等, 2004)。目前，滇重楼资源利用现状窘迫。滇重楼地下根茎生长迟缓，种植效益和经济效益低下，同时滇重楼野生资源由于人类的过度采伐几乎枯竭；因此，开发滇重楼资源全新及高效的利用方式非常重要(周正飞和陆平, 2004, 中国民族民间医药杂志, 66: 12-13)。
滇重楼地上茎叶一年生，每年枯萎，次年长出，一直以来不被有效利用。近年来研究发现，滇重楼茎叶含有与地下根茎相似的皂苷成分和一定的药用效果(陈昌祥等, 1990; 年四辉和刘丽敏, 2007)，并且叶的皂苷含量在全株不同组织器官中仅次于根(邹亮等, 2009)。但是茎叶总皂苷的抗癌研究鲜见报道。
因此，本研究以肝癌细胞HepG2为研究对象，运用细胞核荧光染色、流式细胞术等技术探索滇重楼茎叶总皂苷的抗癌活性，以期为滇重楼资源利用新途径提供一定的理论依据。
1结果与分析
1.1滇重楼茎叶总皂苷对HepG2细胞增殖的影响
随着滇重楼地上茎叶总皂苷浓度的增加和作用时间的延长，细胞活力明显下降，表明其对HepG2细胞的增殖抑制作用具有时间、剂量依赖效应。当作用时间为48 h，仅10 μg/ml就能抑制细胞活力在44.2%，抑制率高于50%；当浓度上升到160 μg/ml时，抑制率高达91.0%。经过回归分析，24 h和48 h的半数抑制率(IC50)分别为40.9 μg/ml和6.18 μg/ml (图1)。
.png) 图 1 不同浓度总皂苷处理不同时间后HepG2细胞的活力 |
1.2滇重楼茎叶总皂苷对细胞凋亡形态的影响
滇重楼茎叶总皂苷处理细胞24小时后(图2)，经Hoechst 33258荧光染料染色，于荧光显微镜下镜检，20 μg/ml处理组的细胞核与对照组(0 μg/ml)差异不明显；40 μg/ml处理组偶见核固缩、致密浓染的细胞，多数正常；80 μg/ml处理组多数细胞核褶皱，常染色质固缩浓染，或呈边集化、新月状。该结果表明当浓度低于40 μg/ml时滇重楼茎叶总皂苷不具有诱导细胞凋亡的能力，40 μg/ml开始表现较弱的诱导凋亡能力，40 μg/ml以上具有较强的诱导细胞凋亡作用。
.png) 图 2 茎叶总皂苷处理24小时对细胞凋亡形态的影响 |
1.3流式术检测总皂苷对细胞周期的影响
随着浓度的升高，可见剂量组相比对照组S期比例逐渐升高(图3)，G2期比例逐渐下降，高剂量组(≥80 μg/ml) G1期细胞比例显著下降，表明滇重楼茎叶总皂苷具有将细胞周期阻滞在S期的作用。
.png) 图 3 滇重楼茎叶总皂苷对HepG2细胞周期的影响 |
1.4流式术分析总皂苷对细胞凋亡的影响
当药物浓度低于80 μg/ml时，未见亚二倍体凋亡峰(图4)，药物诱导细胞凋亡作用不明显；当浓度≥80 μg/ml时，显示出明显的亚二倍体凋亡峰，并且随着浓度的增大而升高。茎叶总皂苷作用于细胞24 h后的细胞凋亡率(表1)，可见细胞凋亡率在低剂量组没有显著差异，在高剂量组显著增大。
.png) 图 4 滇重楼茎叶总皂苷诱导HepG2细胞凋亡的流式术分析 |
.png) 表 1 流式细胞仪检测总皂苷作用于HepG2细胞24小时后细胞的凋亡率 |
1.5总皂苷对Caspase-3凋亡蛋白活性的影响
滇重楼茎叶总皂苷作用24 h后，caspase-3活性在低浓度组(20 μg/ml和40 μg/ml)呈现随浓度升高而降低，高浓度组(80 μg/ml和160 μg/ml)随浓度升高而上升(图5)。该结果说明，低浓度(＜80 μg/ml)总皂苷抑制细胞增殖占主导作用，诱导细胞凋亡作用不显著；高浓度(≥80 μg/ml)诱导细胞凋亡作用显著，且有浓度依赖性。
 图 5 不同浓度总皂苷处理后caspase-3活性变化 |
2讨论
使用由于医疗水平的限制，肝癌是世界上发病率居第六位的癌症，同时也是人类中致死率第三的癌症，在许多亚洲国家的发病率特别高(Farshori et al., 2014)。目前，放疗和化疗仍然是癌症治疗最常用的方法，然而这样的方法不具有特异性并伴有巨大的副作用。抑制细胞凋亡是肿瘤发生发展中关键的因素(Evan and Littlewood, 1998)，因此可以通过诱发癌细胞凋亡进行癌症治疗。近些年来国内外采用天然产物提取物或中药单药、复方对肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用进行研究，取得了可喜的成果(Farshori et al., 2014; 邵淑丽等, 2015; 李云坤等, 2015)，因此天然产物有效成分被认为是抗癌药物开发的新思路。
重楼总皂苷的抗癌活性是判断其是否有相应药效的重要指标之一。本研究结果表明，重楼茎叶总皂苷对肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用具有时间、剂量效应，同时能抑制癌细胞周期于S期并诱导凋亡发生，这与先前根茎总皂苷的部分研究结论相一致(贾科等, 2011; 陈志红等, 2011)。
在正常细胞内，细胞凋亡发生和caspase家族级联反应受到严密的调控(程卉等, 2013; Kashyap et al., 2010)，caspase-3活性维持在一个极低的恒定的水平。HepG2细胞处于指数增长期，24 h内可增殖近一倍(陈富强等, 2007)。低浓度药物不具有(或具有极弱)的诱导细胞凋亡能力却能显著抑制细胞增殖，24 h后剂量组细胞数量显著少于对照组，此时caspase-3活性主要取决于细胞数量而不是表达活性，因此可见caspase-3活性低于对照组；当药物浓度增加到80 μg/ml及以上时，药物表现出了明显的诱导细胞凋亡能力，此时caspase-3活性主要取决于表达量和活化程度而不是细胞数量，因此可见caspase-3活性高于对照组。另外，低剂量组(＜80 μg/ml)诱导细胞凋亡的作用不显著，而高剂量组(≥80 μg/ml)效果显著的具体机制尚不明确，可能与细胞对药物的耐受力或总皂苷中不同有效成分的协同作用有关。
目前，滇重楼人工种植已具有一定的规模，因其地上部分生长迅速，生物质产量远高于地下部分，资源开发潜力相当可观(杨斌等, 2012, 中药材, 35(10): 1698-1700)。今后应尽快深入研究重楼地上茎叶总皂苷抗癌作用的具体机制，为癌症治疗和重楼资源利用开辟新途径。
3材料与方法
3.1实验材料与试剂
滇重楼地上茎叶，2013年10月采自云南省文山州重楼种植基地，经四川农业大学丁春邦教授鉴定为滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz.)。晾干后粉碎常温保存。
肝癌细胞株为Human Hepatocellular Carcinoma Cells (HepG2)，来自四川大学。
二甲基亚砜(美国sigma公司)、DMEM低糖培养基(美国Hyclone公司)、胰蛋白酶(美国Gibco公司)、胎牛血清(美国Hyclone公司)、MTT干粉(中国Biosharp公司)、PI染液(北京索莱宝科技有限公司)、青链霉素混合液(美国Gibco公司)、Hoechst 33258染液(中国碧云天生物技术研究所)、Caspase-3活性检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、甲醇、乙醇、石油醚(60～90℃)、丙酮、4%多聚甲醛、台盼蓝、盐酸等。所有试剂均为分析纯。
3.2实验仪器与设备
滇Synergy HT酶标仪(美国BIO-TEK公司)、Sorvall ST 16R离心机(美国Thermo公司)、Scientz-IID超声波萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)、Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司)、Olympas-Bx53荧光显微镜(奥林巴斯有限公司)。
3.3细胞培养
肝癌细胞株为HepG2，采用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的DMEM低糖培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱饱和湿孵育。细胞贴壁生长，传代时胰蛋白酶消化，800~1 000 rpm离心3~5 min，分至3瓶。2~3天传一代。
3.4总皂苷的提取
采用韦蒙等(2015)的优化提取方案提取滇重楼地上茎叶总皂苷。称取一定量滇重楼茎叶粉末过筛，石油醚(60～90℃)和丙酮依次处理去除色素。甲醇为溶剂，超声波辅助提取总皂苷，甲醇:粉末液料比为1:12 (g/m)、提取温度54℃、超声功率210 W、提取时间2 h，离心取上清液蒸发浓缩得浸膏。所得浸膏经过大孔树脂分离纯化后真空干燥，得到总皂苷粉末。滇重楼地上茎叶总皂苷用细胞培养基溶解，稀释成试验需要的一系列浓度。
3.5 MTT试验
采用收集对数生长期的细胞，以7 000个/孔接种于96孔板，每孔细胞悬液100 μl。对照组和剂量组均设5个复孔，边缘孔用无菌PBS填充。贴壁过夜后，剂量组每孔加药100 μl，使终浓度分别达到10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml和160 μg/ml，对照组加完全培养基100 μl，孵育12 h、24 h和48 h。弃上清，加DMEM完全培养基100 μl和5 mg/ml的MTT溶液10 μl，继续孵育4 h，之后将96孔板中的溶液全部吸出，加入二甲基亚砜150 μl，摇床震荡10分钟后于酶标仪发射波长570 nm，参比波长630 nm检测吸光度，计算抑制率。抑制率计算公式：
3.6 Hoechst 33258荧光染色
细胞浓度为1×105个/ml于6孔板中培养，培养皿中预先植入无菌洁净的盖玻片，使细胞贴壁于盖玻片，过夜，用终浓度为0 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml和80 μg/ml药物作用24 h，4%多聚甲醛4 ℃固定过夜，PBS洗两遍，每遍洗涤3分钟以去净固定液。加入适量10 μg/ml的Hoechst 33258荧光染色10 min，PBS冲洗1遍，装片后置于荧光显微镜(发射波长461 nm，激发波长352 nm)下观察细胞形态和凋亡特征。
3.7流式细胞术检测细胞周期和凋亡率
设置终浓度为0 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml和160 μg/ml浓度药物作用于细胞24 h，每组浓度设置5个平行试验。收集细胞，PBS洗两遍，重悬后加预冷70%乙醇于4℃固定过夜，2000 rpm离心5 min去乙醇，用PBS洗净乙醇，再次离心并重悬。用终浓度50 μg/ml的PI染液避光染色半小时，300目尼龙筛过滤至流式检测管，进入流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。
3.8 Caspase-3含量测定
设置3×106个/瓶的细胞数量于培养瓶中孵化，不同浓度药物(0 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg/ml和80 μg/ml)作用细胞24小时，每组浓度设置4个重复。之后吸出并收集含药培养液，消化细胞，消化悬液与含药培养液共离心(1 000 rpm, 5 min)，PBS洗涤一次，再次离心，按caspase-3活性检测试剂盒说明操作，以分光光度法测定caspase-3表达量，评价细胞凋亡作用。
3.9统计学分析
采运用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析，两组间分析采用t检验，组间分析采用单因素ANOVA，数据以(x±s)表示，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。
作者贡献
许新恒是本研究的实验设计者，同康梦瑶、匡坤燕、杜琳颖和韦蒙为实验主要实施者；李云坤和淦永鉴负责实验的数据分析；许新恒完成论文初稿的撰写；孟风艳和曹晓涵指导实验操作；杜小刚负责项目进度监督及论文写作指导；曾宪垠和曹晓涵帮助论文修改完善。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
感谢四川农业大学科研兴趣培养计划项目(04051659)对本研究的资助。感谢导师和同事们对本研究的大力帮助。
Chen C.X., Zhou J., Zhang Y.T., and Zhao Y.Y., 1990, Steroid saponins of aerial parts of Paris polyphylla var. yunnanensis, Yunnan Zhiwu Yanjiu (Acta Botaniea Yunnanida), 12(3): 323-329 (陈昌祥, 周俊, 张玉童, 赵永言, 1990, 滇重楼地上部分的甾体皂甙, 云南植物研究, 12(3): 323-329)
Chen F.Q., Li Y., Li Y., Wang Z.F., and Jia R.Z., 2007, Analysis on the characterization of human hepatoma cell line HepG2, Neimenggu Daxue Xuebao (Zirankexue Ban) (Journal of Inner Mongolia University), 38(3): 306-310 (陈富强, 李煜, 李瑶, 王振飞, 贾瑞贞, 2007, 人肝癌细胞系HepG2生物学特性分析, 内蒙古大学学报(自然科学版), 38(3): 306-310)
Chen Z.H., Gong X.L., and Liu Y., 2011, Effect of total saponins of paris polyphylla root on cell cycle and apoptosis of CNE-2Z cells, Zhongchengyao (Chinese Traditional Patent Medicine), 33(1): 25-29 (陈志红, 龚先玲, 刘义, 2011, 重楼总皂苷对人鼻咽癌细胞CNE-2Z周期及凋亡的影响, 中成药, 33(1): 25-29)
Cheng H., Su J.J., Hou H.J., and Li Q.L., 2013, Effect and mechanism of Polyphyllin Ⅰ on human cervical cancer cell HeLa in vitro, Zhongyaocai (Journal of Chinese Medicinal Materials), 36(11): 1815-1819 (程卉, 苏婧婧, 候会洁, 李庆林, 重楼皂苷Ⅰ抗宫颈癌HeLa细胞作用及机制研究, 中药材, 2013, 36(11): 1815-1819)
Evan G., Littlewood T., 1998, A matter of life and cell death, Science, 281: 1317-1322
Farshori N.N., Al-Sheddi E.S., Al-Oqail M.M., Musarrat J., Al-Khedhairy A.A., and Siddiqui M.A., 2014, Cytotoxicity Assessments of Portulaca oleracea and Petroselinum sativum Seed Extracts on Human Hepatocellular Carcinoma Cells (HepG2), Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 15(16): 6633-6638
Jia K., Wu Q.C., and Zhang C., 2011, Effects of total saponins of paris polyphylla root on growth of gastric carcinoma cell line MGC-803 in vitro, Zhongguo Shenghua Yaowu Zazhi (Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics), 32(4): 284-286, 290 (贾科, 吴庆琛, 张成, 2011, 重楼总皂苷对胃癌细胞株MGC-803生长的抑制作用, 中国生化药物杂志, 32(4): 284-286, 290)
Kashyap M.P., Singh A.K., Siddiqui M.A., Kumar V., Tripathi V. K., Khanna V. K., Yadav S., Jain S. K., and Pant A.B., 2010, Caspase Cascade Regulated Mitochondria Mediated Apoptosis in Monocrotophos Exposed PC12 Cells, Chemical Research in Toxicology, 23(11): 1663-1672
Li Y.K., Du L.Y., Gan Y.J., Zeng X.Y., Meng F.Y., Zhang Z.J., and Du X.G., 2015, Anti-Proliferative Effects of the Ethyl Acetate Extract from Shells of Camellia oleifera on Human Hepatocellular Carcinoma Cells (HepG2), Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 34(11): 2299-2305 (李云坤, 杜琳颖, 淦永鉴, 曾宪垠, 孟凤燕, 张正菊, 杜小刚, 2015, 油茶籽壳乙酸乙酯提取物对HepG2抗增殖作用及机制研究, 基因组学与应用生物学, 34(11): 2299-2305)
Nian S.H., and Liu L.M., 2007, An Experimental Research on the Development of Ground Part of Rhizoma Paridis, Yunnan Zhongyi Zhongyao Zazhi (Yunnan Journal of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica), 28(4): 35-36 (年四辉, 刘丽敏, 重楼地上部分初步开发实验研究, 云南中医中药杂志, 2007, 28(4): 35-36)
Pharmacopoeia Commission of the P.R.C., ed., 2010, Pharmacopoeia of the People's Republic of China, China Medical Science Press, Beijing, China, pp.243-244 (国家药典委员会, 主编, 2010, 中华人民共和国药典, 中国医药科技出版社, 中国, 北京, pp.243-244)
Shao S.L., Liu S.N., Zhang L., Zhang W.W., and Chen L., 2015, Cinobufacini Induced Apoptosis in Gastric Cancer Cells SGC-7901, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 34(9): 1826-1832 (邵淑丽, 刘盛楠, 张蕾, 张伟伟, 陈琳, 2015, 华蟾素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡, 基因组学与应用生物学, 34(9): 1826-1832)
Wei M., Xu X.H., Li J.L., Shen S.A., Liu J., and Ding C.B., 2015, Extraction and Antioxidant Activity of Total Saponins from Stems and Leaves of Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz., Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa (Natural Product Research And Development), 27: 1794-1800 (韦蒙, 许新恒, 李俊龙, 申世安, 刘静, 丁春邦, 2015, 滇重楼茎叶总皂苷提取工艺优化及其体外抗氧化活性分析, 天然产物研究与开发, 27: 1794-1800)
Wu S.S., Gao W.Y., Duan H.Q., and Jia W., 2004, Advances in studies on chemical constituents and pharmacological activities of Rhizoma Paridis, Zhongcaoyao (Chinese Traditional and Herbal Drugs), 35(3): 344-347 (武珊珊, 高文远, 段宏泉, 贾伟, 2004, 重楼化学成分和药理作用研究进展, 中草药, 35(3): 344-347)
Xia Y.F., and Yan S., 2012, Advances on Studies of Antitumor Mechanisms by Rhizoma Paridis, Zhongguo Shiyan Fangjixue Zazhi (Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae), 18(9): 304-307 (夏亚飞, 阎姝, 2012, 重楼抗肿瘤作用机制研究进展, 中国实验方剂学杂志, 18(9): 304-307)
Zou L., Zhou N., Zhang H.Z., Xia C.L.,Yi Q.Y., and Zhao G., 2009, Determ ination of four saponins in Paris polyphylla var. yunnanensis from different habitats by HPLC, Huaxi Yaoxue Zazhi (West China Journal of Pharmaceutical Sciences), 24(5): 521-523 (邹亮, 周浓, 张海珠, 夏从龙, 易秋艳, 赵钢, 2009, HPLC测定不同产地滇重楼中的4种重楼皂苷, 华西药学杂志, 24(5): 521-523)
