芥蓝(Brassica oleracea L varalboglabra Bailey)是我国南方特产蔬菜，以秋冬生产为主，收获期是齐口期，即抽薹开花始期，此时植株正经历营养生长向生殖生长的转换，受温光环境因素影响很大，如低温利于春化作用诱导齐口期，而高温则阻滞生长、降低菜薹产量和品质等(关佩聪，1989年；杨暹和杨运英，2002年；刘厚诚等，2003)，因此，齐口期不但是生产上常用的品种分类标准，也是育种和种质资源鉴定的重要指标。

通过模式植物拟南芥的研究发现，春化诱导开花与微量的短暂的DNA甲基化水平降低相关(Burn et al., 1993; Finnegan et al., 1996; 1998; Sheldon et al., 1999)，DNA甲基化水平降低也能够诱导白菜、菜心、萝卜和青花菜等的抽薹开花(李梅兰等, 2002；2003；汪炳良等，2005；柳铁旺等，2006；王薇等，2008；于锡宏等，2008)，认为DNA甲基化作为表观遗传的重要形式，参与春化途径调控并可能起着整合因子作用(Sheldon et al,2000;Schmitz and Amasino, 2007)，也有研究认为DNA甲基化水平降低和春化作用是通过不同的调控途径诱导开花时间关键基因FLOWERING LOCUS C (FLC)下调表达的(Finnegan et al, 2005)。

检测甲基化的诸多方法中，MSAP (methylation sensitive amplified polymorphism)与AFLP原理相同，如两者均无需了解全基因组序列信息，采用长寡核苷酸随机引物进行PCR反应，利用聚丙烯酰胺凝胶进行产物分离，既保留RFLP的可靠性又保留PCR的精确性和高效性，成为多态性检测效率非常高的分子标记技术。不同之处是MSAP选用HpalI和MspI酶切DNA，这对同裂酶能够检测基因组DNA上CCGG位点的胞嘧啶甲基化状态(McClelland et al.1994)，结果MSAP既能象AFLP一样检测基因组DNA的序列差异，又能检测由非序列变化引起的表观遗传差异，演变成一种结构与功能相结合的分子标记，在十字花科植物研究上得到广泛应用，如拟南芥、白菜、油菜、萝卜的发育调控、种质资源鉴定、抗逆性或多倍化后代的甲基化分析(Cervera et al,2002; 陆光远等，2005；齐心，2006；李象松等，2010；柳铁旺等，2006；Salmon et al,2008)。但在芥蓝种质资源鉴定上还没见报道，由于芥蓝种质资源狭窄，齐口期易受环境因素影响，常规的分子标记技术仅能检测出基因组结构变异，为此本研究利用MSAP检测18个芥蓝DNA甲基化水平，分析齐口期表观遗传多样性，探讨DNA甲基化对齐口期的影响，旨在为芥蓝育种和栽培生产提供理论依据。

1结果与分析

1.1芥蓝齐口期分析

18份芥蓝齐口期和叶片数的调查结果如下(表1)，齐口期最少为35天(澄海芥蓝菜和大丰芥蓝)，最多的75天(正源澄海粗条芥蓝)，多数品种为40-60天，平均为50天。齐口期叶片数最少的为8片(正源四季甜芥蓝、白花尖叶粗苔甜芥蓝、甜脆黄花尖叶芥蓝)，最多的为15片(泰国芥蓝)，平均叶片数为10片。齐口期和叶片数相关系数为0.296，两者不相关，即叶片数不随齐口期变化。变异系数表示性状离散性特征,  高值代表性状离散程度大，本研究中的齐口期为21%，叶片数为18%，表明齐口期变异程度大与叶片数。

表 1 芥蓝品种及表型特性

根据18个芥蓝的齐口期和叶片数，利用DPS数据处理系统计算遗传距离，变化范围是 0~40，平均值为12.2276。正源澄海粗条芥蓝和澄海芥蓝菜的遗传距离最大(40)，香港白花甜芥蓝和正源大笋黄花芥蓝、正源四季甜芥蓝和绿宝芥蓝，白花尖叶粗苔甜芥蓝和甜脆黄花尖叶芥蓝的遗传距离最小，表明几个品种亲缘关系最近。

利用欧式距离和类平均法进行聚类分析，在遗传距离10.62处分为3类，第一类是齐口期为35-50天之间的品种，包括白花甜芥蓝、甜脆白花尖叶芥蓝、泰国中迟花粗茎尖叶芥兰、香港白花甜芥蓝、正源大笋黄花芥蓝和中花芥蓝、顺宝芥蓝、白花尖叶粗苔甜芥蓝、甜脆黄花尖叶芥蓝、大丰芥蓝和澄海芥蓝菜。第二类是齐口期为55-60天的品种，包括正源大笋香菇芥蓝、大芯四季香菇芥蓝104、正源大笋迟花芥蓝、泰国芥蓝、正源四季甜芥蓝和绿宝芥蓝。第三类为齐口期75天的正源澄海粗条芥蓝。

图 1 芥蓝齐口期表型聚类分析

1.2芥蓝MSAP分析

利用5对MSAP引物组合扩增18个芥蓝品种，一共得到432条带，平均每条引物86条，其中 201条片段表现出多态性，推测芥蓝甲基化多态性比率为47%(201/432)，可见MSAP检测芥篮种质资源遗传多样性的效率很高，芥篮遗传多样性也较丰富(图2)。

图 2 芥蓝MSAP聚类分析

 选用EcoR I和Msp II组合获得的多态性条带，利用GenAlEx 6.4软件计算18份品种的Nei遗传距离，分布范围是 0.004~0.467，平均值为0.0958，表明遗传多样性水平较低。中花芥蓝和顺宝芥蓝的遗传距离最小(0.004)，泰国中迟花粗茎尖叶芥篮与澄海芥蓝菜最大(0.467)。

按照UPGMA方法，利用Nei遗传距离进行聚类分析，在遗传距离0.04处，可以将18份品种分为3类，第一类中花芥蓝、顺宝芥蓝、正源大笋香菇芥蓝、甜脆黄花尖叶芥蓝、正源大笋迟花芥蓝、绿宝芥蓝、香港白花甜芥蓝、正源澄海粗条芥蓝、甜脆白花尖叶芥蓝、大丰芥蓝、大芯四季香菇芥蓝104、白花甜芥蓝、正源大笋黄花芥蓝、澄海芥蓝菜、白花尖叶粗苔甜芥蓝。第二类为泰国芥蓝，第三类为正源四季甜芥蓝，第四类为泰国中迟花粗茎尖叶芥篮(图3)。

图 3 18个芥蓝品种的MSAP电泳图  注：1~18品种见表1； H、M代表 EcoRⅠ+Hpa Ⅱ和 EcoRⅠ+MspI酶切组合；M：marker

1.3芥蓝齐口期和MSAP相关性检验

18份芥篮的MSAP与齐口期聚类分析结果不一致，为验证两种分析的相关程度，利用mantel test检验齐口期遗传距离和MSAP遗传距离相关性，相关系数为-0.1366，表明齐口期、叶片数和基因组DNA甲基化相关不显著。

1.4芥篮DNA甲基化模式分析

DNA甲基化多态性片段可以归纳为3种带型(表2)，类型一为两种内切酶均能酶切的带型(EcoRⅠ+MspI/EcoRⅠ+Hpa Ⅱ)，代表非甲基化；类型二为EcoRⅠ+ MspI酶切带型，表示双链内胞嘧啶甲基化(M)；表2 18份芥蓝品种MSAP带型分析类型三为EcoRⅠ+HpaⅡ酶切带型，表示单链外部胞嘧啶的半甲基化(H)。本研究非甲基化片段为110条，甲基化多态性片段为322条，可分3种类型，类型一的变化范围为110条(澄海芥蓝菜)~160条(泰国中迟花粗茎尖叶芥篮)，类型二为63条(澄海芥蓝菜)~172条(泰国中迟花粗茎尖叶芥篮)，类型三为52条(白花甜芥蓝)~116条(香港白花甜芥蓝)。类型二平均数量为110条，少于类型三152条，类型三为半甲基化类型。在不同品种之间，78%(86/110)的非甲基化片段和92%(141/152)的半甲基化片段呈现多态性，而甲基化片段中，多态性与单态性相差不大，表明芥蓝较高的MSAP多态性主要来源于前两者，甲基化模式以半甲基化为主。

表 2 18份芥蓝品种MSAP带型分析

2讨论

作为南方地区的重要叶菜，芥蓝形态性状丰富，其中齐口期作为重要的商品和产量性状，受环境(特别是低温)、生长发育规律、品种、播种期及矿质营养等的影响较大(关佩聪等，1989；杨暹等，2002；张静等，2008)。本研究18份芥蓝齐口期变异系数达21%，正是诸多影响因素的综合反映。聚类分析中除香港白花甜芥蓝、正源大笋黄花芥蓝、白花尖叶粗苔甜芥蓝和甜脆黄花尖叶芥蓝外，其余14份芥蓝基本按照齐口期分类，证明齐口期可以作为种质资源鉴定的可靠指标，但香港白花甜芥蓝和正源大笋黄花芥蓝，白花尖叶粗苔甜芥蓝和甜脆黄花尖叶芥蓝具有非常小的遗传距离，显示其亲缘关系紧密，而黄花和白花芥蓝属于不同的栽培品种(刘海涛等，1997)，这又说明齐口期分类仍具有局限性，不能反映出其它表型特征，所以在利用表型研究遗传多样性时，性状一定要丰富和典型，才可能反映种质资源的真实特性。

高等植物DNA的甲基化比例变化很大(Finnegan et al，1993)，与拟南芥、甘蓝、油菜和萝卜等的MSAP分析相比，本研究中MSAP检测的芥篮甲基化比例为47%，低于芥蓝与萝卜四倍体的30.61%~33.10%(F₄~F₁₀)(李象松等，2010)和甘蓝的53.3~60.7%(Salmon et al，2008)，高于拟南芥的24%~34%(Cervera et al，2002)、油菜的15%(陆光远等，2005)和5%~13.4%(柳李旺等，2006)，暗示同为十字花科植物，尽管亲缘关系紧密，但基因组甲基化水平在不同物种之间还是有差别的。MSAP聚类分析发现品种间遗传距离也较小，分布范围在 0.004~0.467之间，与RAPD和SRAP检测结果基本一致(陈文文等，2011；李桂华等，2011)，即芥蓝遗传多样性水平较低，即使本研究参试品种较少。两个泰国品种各具一类，可能反映了品种来源的地理差异，毕竟本研究的多数品种来源于中国并分在一组。

十字花科植物表型和分子标记分类常不一致，将两种鉴定方法结合运用则是评价遗传多样性比较有效的方法(郭晶心等，2002;杨华等，2005)。本文芥蓝齐口期、叶片数和DNA甲基化多态性不相关，意味着仅根据一种鉴定来推测遗传多样性不十分理想。究其原因可能在于芥蓝起源且主要种植在南方地区，遗传多样性受地域限制而较低(陈文文等，2011；李桂华等，2011)，再次由于MSAP只检测CCGG位点甲基化水平，即不能反映出其他类型甲基化变异，检测出的甲基化水平偏低，最后检测不出基因组序列变化，所以出现两种分类不一致的现象。研究发现拟南芥表观遗传变异可占植株高度和开花时间表型变异30%(Johannes et al. 2009)，而且拟南芥不同生态型具有不同的甲基化调控机制，使得亲缘关系紧密的拟南芥由于甲基化多态性不相关而不能归为一类(Cervera et al，2002)，因而DNA甲基化与表型相关性可能无明显规律可循(Oliver et al，2010)，在芥蓝与萝卜杂种上也存在这个现象(李象松等，2010)，在水稻上与表型相关的表观标记更可能出现在亲缘关系紧密的品系中(Takata et al,2005)，本研究MSAP结果与已有分子标记研究相同，也能够揭示地里信息，仍不失为芥蓝种质研究的较好方法。

抽薹开花是一个受多基因和多途径调控的过程，DNA甲基化参与春化作用调控(Michaels and Amasino, 1999; Sheldon et al., 2000; Schmitz and Amasino,2007)。本研究芥蓝DNA甲基化多态性主要来源于非甲基化片段和半甲基化片段，甲基化模式以半甲基化为主，说明在自然条件下的齐口期DNA甲基化水平降低，与利用去甲基化试剂(5-aza)处理降低DNA甲基化水平取得的效果相同(Burn et al., 1993; Finnegan et al., 1998; 李梅兰等, 2002；2003；汪炳良等，2005；王薇等，2008；于锡宏等，2008)，所以本文认为DNA甲基化水平降低与芥篮齐口期调控有关，但是否如油菜上去甲基化归因于春化作用的结论(Filek et al, 2006)，还有待后续实验证实，研究也表明MSAP分子标记除了用于结构基因组研究，还可以用于功能基因组研究。

3材料与方法

3.1参试品种及播期

试验于2008年秋季在广西农业科学院蔬菜中心蔬菜基地进行，品种编号见表1。直播。从每个品种选择10株记录齐口期和叶片数，采集叶片用液氮冷冻于-70℃冰箱。

3.2 DNA提取

采用CTAB的方法:取2-3g叶片，用液氮研碎，加入DNA提取液(含1.5%的 CTAB，1%巯基乙醇)，65℃水浴90min，加入氯仿：异戊醇(24：1)，抽提2次后，加RNA酶37℃温浴过夜，苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)纯化，样品DNA用ddH₂O溶解和保存。

3.3 MSAP分析

参照xiong和陆光远等的方法。酶切连接一步法反应体系和步骤：25μl反应体系：Mse I adaptor ( 50 pmol/μl ) 1μl，EcoR I adaptor ( 5 pmol/μl ) 1μl，T4 buffer 2.5μl，T4 ligase 1.5 U，100×BSA 0.25μl，Mse I 3 U，EcoR I 3 U，DNA 2μl，双蒸水补足至 25μl。将上面反应体系的PCR管在37℃水浴锅中处理10 hr，然后转到70℃处理15 min，稀释十倍，作为预扩增模板。预扩增体系：10×buffer 2μl，Mg₂CL (25 mmol/l) 1.6μl，dNTP (10mM/L) 0.4μl，Taq 酶 (2U/μl ) 0.5μl，Mse I ( 50ng/μl)1μl，EcoR I ( 50ng/μl ) 1μl，DNA 3μl，H₂O 12.1μl。反应条件：94 ℃ 预变性3′；94 ℃变性30 ″，56 ℃退火30 ″，72 ℃ 延伸 1′，一共25份循环； 72℃延伸7′；4℃保存。预扩增引物序列参考Salmon (2008)。选扩增体系：10×buffer 2μl，Mg₂CL (25 mmol/l) 1.6μl ，dNTP (10mM/L) 0.4μl，Taq 酶 (2U/μl ) 0.5μl，Mse I ( 50ng/μl) 1μl，EcoR I ( 50ng/μl ) 1μl，DNA 3μl，H₂O 12.1μl。反应条件：94 ℃ 预变性3′；94 ℃变性30 ″，65℃退火30 ″每循环下降0.7℃，72℃延伸1′，一共23份循环；72℃延伸 7′；4℃保存。6％聚丙烯酰胺胶电泳检测扩增产物，银染法染色显影。

3.4数据分析

采用DPS数据处理系统对开花期和叶片数进行系统聚类分析。MSAP分析参考Salmon(2008)，记载选择性扩增反应的条带数，清晰可见的条带设为1，肉眼不可见或模糊不清的条带设为0，将统计的条带记为数字矩阵，利用Excel计算甲基化多态性比率和甲基化类型。利用GenAlEx 6.4 软件计算Nei分子遗传距离和聚类分析，利用mantel检验；两种分析的遗传距离相关性。

作者贡献

史卫东是本项目的实验设计、实验研究和数据分析的执行人，完成论文写作与修改。李秋雯参与MSAP实验；黄如葵、赵坤提供部分试验材料；王益奎参与数据分析。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究获得广西农业科学院基本科研业务专项(2012JZ06和桂农科2012YT05)、广西作物遗传改良生物技术重点实验室开放课题子课题(桂科能0815011-6-1)资助。感谢评审人的评审意见和修改建议。

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