脑血管疾病一直是世界范围内的高发疾病，其病死率有逐年上升的趋势，严重威胁着人类的健康。因此，防治脑血管疾病的发生具有重要意义。脑血流流通不畅，供应障碍，引起脑组织缺血、缺氧性坏死或软化是脑缺血的主要病因(Kulik et al., 2008)。现代医学、生物学的的研究在脑血管疾病的诊断、治疗和防治等方面都取得了较大的突破，但脑血管疾病本身具有治愈率低、发病率高、并发症多、死亡率高和预后恢复差等特点(孙雅瑄等, 2010)。黄连作为抗菌药有着古老的历史，长期以来在临床上用于解热镇痛、抗细菌感染。近来研究发现黄连在治疗心脑血管疾病方面有应用价值，如降血脂、血糖、抗心律失常、抗血小板聚集等药理作用(余园媛等, 2006)。尚鲜见其对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用的相关报道。

脑梗死的病理生理机制之一是脑缺血再灌注损伤(颜景峰等, 2010)，本实验通过结扎法同时结扎双侧颈总动脉，制作小鼠脑组织急性缺血再灌注模型，观察黄连水煎液对模型小鼠脑组织SOD、MDA及Evan's蓝含量的影响，研究其对抗小鼠脑缺血再灌注损伤的机制。

1结果与分析

1.1脑组织Evan's 蓝含量检测

Evan's蓝属于一种常用的偶氮染料，因其分子量大小与血浆白蛋白相近，而且在血液中与血浆白蛋白有很高的亲和力，据此，在神经科学研究中常被用于示踪剂观察血脑屏障的完整性。

本研究中，模型对照组小鼠脑组织Evan's蓝含量大幅升高，说明脑组织受损严重，模型制备成功，黄连水煎液治疗组使Evan's蓝含量降低，且各组之间存在差异，中剂量组效果较好(表1)。

1.2脑组织SOD、MDA 含量检测

SOD是肌肉组织内重要的抗氧化酶，通过清除缺血组织氧自由基发挥保护作用，主要作用机制是催化超氧阴离子歧化反应，其被认为是活性氧防御的重要机制(程发峰等, 2010)。SOD含量、活力的降低，导致自由基的堆积，后者在不饱和脂肪酸中发生一系列反应，并以链式或链式支链反应的形式形成脂质过氧化物(Mami et al., 2011)。SOD含量可判断组织损伤程度。脑组织急性缺血时，细胞内Ca²⁺超载，自由基生成量增加，清除能力下降，作用于细胞膜和血液循环中的脂质，使其发生脂质过氧化，并最终分解为MDA，导致细胞膜和细胞功能的损伤，并大量消耗抗氧化剂，使SOD活力失偿性下降，从而启动自由基连锁反应，进一步破坏血管内皮的结构和功能，甚至内皮细胞凋亡，直接损伤脑组织。研究表明，有效地清除自由基，降低过氧化脂质的生成在脑血栓的治疗中具有重要的意义。

模型对照组小鼠脑组织受损严重，出现MDA含量升高、SOD含量降低的情况，黄连水煎液治疗组使MDA含量降低，SOD含量升高，且各组效果较显著(p<0.05) (表2)。

2讨论

本模型制备对于实验操作者的手法要求很高，实验过程中有多处要注意的操作步骤。结扎暴露的双侧颈总动脉时，不要损伤迷走神经，不然，会造成小鼠的死亡。精确的操作尽快分离肌肉与神经，暴露双侧颈总动脉并结扎，确保模型的成功率、稳定性、成活率。实验过程中如果出血，不应盲目结扎法止血，以免造成不必要的损伤，用棉签压迫出血点，大多数情况下可以减少出血。麻醉剂量应做到精确，力争一次麻醉成功，不可多次麻醉(韩蕾等, 2012)。同时，手术过程中要密切关注动物的呼吸情况，及时吸痰，避免呼吸道分泌物增多出现的气道堵塞，从而降低动物的死亡率。

脑缺血再灌注时，各种损伤机制会导致血脑屏障的破坏，从而使一些平时不能通过的大分子物质得以通过(程发峰等, 2010)。Evan's 蓝能与血浆蛋白结合，正常时不能透过血脑屏障，脑缺血再灌注时，血脑屏障的通透性的增大，脑组织中的Evan's 蓝含量大幅升高，因此，测定Evan's 蓝含量能反映出血脑屏障损伤程度及通透性的变化情况。初步研究表明：黄连水煎液能降低脑缺血组织中的Evan's 蓝含量，提高脑缺血组织中SOD的含量，降低MDA含量，有良好的抗自由基作用。在保护屏障的完整性维持、急性脑缺血损伤保护等方面有较好的作用。抗氧化酶SOD活力的高低直接反应了机体清除氧自由基的能力(雷军荣等, 2010)。MDA是自由基膜过氧化脂质的一种重要的分解产物，含量可以反映机体内脂质过氧化的程度，常被用以作为脂质过氧化程度的检测指标，MDA的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度(韩辉等, 2012)。

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1药物

黄连水煎液，取黄连100 g，捣碎，浸泡10 倍量体积份数的热水中，煮沸提取3 次，每次2 h，合并滤液稀释至1 000 mL，即100 mg/mL，另取该液适量分别用蒸馏水稀释至浓度为50 mg/mL、25 mg/mL，备用。

3.1.2动物

清洁级小鼠50只，雌雄各半，20~25 g，由遵义医学院实验动物中心提供。

3.1.3主要试剂

Evan's 蓝(2%)购于上海宝曼生物科技有限公司，丙二醛(MDA)、抗氧化酶(SOD)测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

3.1.4主要仪器

721 型分光光度计(上海分析仪器厂)、高速离心机(Thermo Fisher D-37520)、电子天平(LG-PABER)、酶标仪(Bio-rad680)。

3.2方法

3.2.1小鼠急性脑组织缺血再灌注模型的制备与分组

给药将50只小鼠按体重随机分假手术对照组、模型对照组黄连水煎液治疗组(25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL) 5组，每组10只，采用双侧结扎法制备模型。腹腔注射7%水合氯醛350 mg/kg 麻醉，无肌张反射后，固定四肢和头部使小鼠仰位躺在手术台上，颈部正中靠近气管部位开口(长度1 cm左右)，玻璃分针分离两侧动脉和迷走神经，用手术线分别结扎60 min后，剪断手术线再灌注，缝合开口。假手术对照组，相同操作但不结扎，暴露60 min后缝合开口。模型制备成功24 h后分别给以黄连水煎液(25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL)药物干预，按体重0.1 mL/10 g，1次/d灌胃给药，7 d后取材进行相关指标检测。

3.2.2组织匀浆的制备

冰盘上取出全脑，分离嗅球、小脑和脑干，冷生理盐水洗去血迹，滤纸吸去多余水分(留出约2 000 mg)，称重后加9 倍生理盐水制备10%脑组织匀浆，匀浆液经2 500 r/min 离心5 min，取上清置-20℃冰箱冻存备用。

3.2.3 Evan's 蓝标准曲线的制作

配制一系列浓度不同的Even's蓝标准溶液(0.002 mg/mL, 0.003 mg/mL, 0.004 mg/mL, 0.005 mg/mL, 0.006 mg/mL, 0.007 mg/mL, 0.008 mg/mL, 0.009 mg/mL, 0.010 mg/mL)分别测定其吸光度，然后选取Evan's浓度(C)为横坐标，选取吸光度值(A)为纵坐标，绘成标准曲线(图1)。

3.2.4脑组织SOD、MDA、Evan's含量测定

取制备好的脑组织匀浆，按SOD、MDA试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上495 nm处测各孔吸光值，求得脑组织对应的SOD、MDA含量。

取已取好的组织100 mg，加5 mL甲酰胺制成匀浆，加盖后于60℃水浴箱孵育48 h (韩蕾等, 2012)，3 500 r/min离心10 min，得上清，去沉淀。在721分光光度计上λ=625 nm处进行测定，根据标准曲线比色，求得Evan's蓝含量(μg/100 mg湿重)。

作者贡献

许朋为遵义医学院药物化学专业在读研究生，负责实验方案设计、论文纂写；牛宪立负责动物实验实施；魏妮娜负责论文数据处理及统计学分析；姬可平负责实验、论文指导。

致谢

本研究由贵州省科学技术基金项目(黔科合J字LKZ [2010] 40 号)资助。

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