铁皮石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)的一种药用植物。铁皮石斛的茎经加工炮制，边炒边扭成螺旋形称为铁皮枫斗，味淡微咸，不寒凉，有生津益胃，养阴清热除烦的功能。可治口干烦渴，病后虚热或阴虚眼目不明，老年人体虚津液不足等。铁皮石斛在民间有“神仙草”之称，被《道藏》列为“中华九大仙草”(铁皮石斛, 天山雪莲, 三两重人参, 一百二十年首乌, 花甲之茯苓, 苁蓉, 深山灵芝, 海底珍珠, 冬虫夏草)之首。

铁皮石斛具有兰科植物的通用特性，其种子微小如同灰尘，因为没有胚乳，无法像别的植物种子那样靠自身储存的养分生长，必须在有兰根菌的环境中才能正常发芽生长成兰花(兰根菌为兰花幼苗提供养分) (Mohammad et al., 2013; Tan et al., 2014)。因此，兰花播种难度大，一般不作为种苗繁育的主要方法。而分株繁育速度太慢，不能满足市场需求。因此，组织培养技术成为铁皮石斛种苗生产的主要途径。目前，铁皮石斛组培苗生产技术已经非常成熟，常用的生产铁皮石斛的组培方法，是利用无菌播种来实现的(唐桂香等, 2005; 杨柳平等, 2012)。无菌播种利用的外植体是铁皮石斛的种子，借助了石斛种子数量巨大的特点，可直接获得大量种苗，成本低，速度快，但不能完全保持母本的优良特性。因此，探索铁皮石斛营养器官诱导出的类原球茎体(protocorm-like bodies,PLBs)的快速繁殖成为铁皮石斛产业化的关键。液体培养周期短，比同样的固体培养速度快，为铁皮石斛PLBs的快速繁殖提供了有利条件，其培养条件都已经比较成熟(宋经元等, 2004; 韩晓红等, 2010)。但对于没有接触过铁皮石斛或其它兰花培养的业者而言，由于不同兰花培养的条件不完全相同，在何种状态时调整培养基配方转入下一阶段还是较难判断的。为此，本研究展示了以铁皮石斛类原球茎体液体振荡培养过程中的形态学变化，为铁皮石斛的工厂化生产和其它兰科植物的离体繁育技术控制提供了实用的参考。

1结果与分析

1.1类原球茎体的诱导

铁皮石斛茎段侧芽萌发形成的无菌苗，切段后，在M2培养基中培养2~3个月，可诱导出浅色的类原球茎体(图1 A)。这些PLBs 与种子直接诱导的原球茎体不同的是，其形状不太规则，颜色发白，没有毛状体。

1.2液体培养体系的建立

将诱导获得的白色的PLBs转入培养基M3进行液体振荡培养，在初期(1个月内)振荡培养过程中，类原球茎体主要以白色PLBs的状态进行增殖(图1 B)，增殖量为10%~15% (重量比)/10 d。

1.3类原球茎体液体培养快速繁殖

液体振荡培养1个月后，PLBs的增殖速度逐渐加快，2个月后，可达到30%~50%/15 d(重量比)的增殖速率。培养2个月后，每250 mL三角瓶中的PLBs可达200 mL，各培养周期结束时，瓶内添加的200 mL的液体培养基几乎没有剩余(图1 C)。PLBs多数簇生，少量单个，浅绿色半透明状，并不断增生新的PLBs。培养2个月后，随着每瓶数量的增加，部分PLBs开始出现萌发状态，顶部变尖，这类外植体肉眼可分辨(图1 D~1 F)。此类PLBs应转移到萌发培养基进行萌发培养。

1.4 PLBs的萌发、壮苗及生根

PLBs在萌发培养基上培养2个月后，由半透明状转为不透明的绿色，第一片叶萌出。转接到壮苗培养基上，萌发出第二叶片后，进而转接到生根培养基进行生根培养(图1 G~J)。

1.5炼苗及移栽

无菌生根苗丛中有芽高2 cm以上，根长1~2 cm时，即可转入大棚炼苗。5 d后，清洗掉根部的培养基，移栽到湿润的基质上，遮阴保湿，移栽成活率90%以上(图1 K)。

图 1 铁皮石斛液体振荡培养PLBs 发育过程图 Figure 1 Development of PLBs during liquid oscillation culture of D. officinale

2讨论

大量的研究报道和生产实践表明，由种胚获得的PLBs 可以在固体培养基上增殖并发育成植株(唐桂香等, 2005; 杨柳平等, 2012)，利用液体悬浮培养进一步提高了PLBs 的增殖速率(宋经元等, 2004; 韩晓红等, 2010)。液体悬浮培养，可以使PLBs 充分接触到培养基，并有充足的空气，因此PLBs 的增殖迅速，增殖系数明显高于同样成分的固体培养基。用于铁皮石斛的种苗生产，可节省大量的人力。但PLBs在液体培养基中的培养时间可能会影响PLBs 的变异率(苏钛和张晓南, 2009)，因此需要在适当的时期转至固体培养基上进行成苗诱导。本研究展示了铁皮石斛PLBs 液体培养过程中各个阶段的PLBs 的形态特征，明确了PLBs 转入固体培养基上的较佳时期。由于不同铁皮石斛种质、不同兰花种类的PLBs的繁殖速度不同，因此，以时间为标准确定该时期，具有较大的误差，影响繁殖进程。所以，以PLBs 的形态特征为标准进行培养基的更换，对各种兰花PLBs的培养有更实用的参考价值。

3材料与方法

3.1材料

铁皮石斛(Dendrobium officinale)茎段。

3.2方法

3.2.1外植体消毒

取铁皮石斛落叶的茎段，于工作台上清理膜质化的茎皮，切成2 cm 左右的段，用0.1% HgCl₂ (加吐温-80)消毒8 min，期间不断摇动。然后用无菌水冲洗4 次，每次2 min，无菌纸吸干水分，切成带一腋芽的茎段，基部插入芽诱导培养基中(M1: MS基部培养基+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+香蕉70 g/L+卡拉胶6.5 g/L, pH 5.8)。

3.2.2 PLBs 的诱导

萌发的无菌苗切段后，接入PLBs 诱导培养基(M2: MS 基部培养基+BA 10.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+卡拉胶6.5 g/L, pH 5.8)，获得白色的PLBs。

3.2.3液体振荡培养

将白色的PLBs 2~5 g 转入液体培养基(M3:MS 基部培养基+BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L, pH 5.8) (50 mL 三角瓶, 25 mL 培养基)，在150 r/min，(26±1)℃条件下培养1 个月，每10 d 继代1 次。然后继续利用培养基M3 (250mL 三角瓶, 150~200mL培养基)在200 r/min，(26±1)℃培养2 个月，每15 d 继代1 次，获得大量的PLBs。

3.2.4 PLBs 萌发成苗

将PLBs 平铺在芽诱导培养基(M4:MS 基部培养基+BA0.2mg/L+NAA0.05mg/L+卡拉胶6.5 g/L, pH5.8)培养2 个月后，PLBs 初步萌发，然后分丛转入壮苗培养基(M5: MS 基部培养基+BA 1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+椰子乳100 mL/L+卡拉胶6.5 g/L, pH 5.8)培养4 个月，期间继代1 次，并根据苗量分瓶。

3.2.5生根及移栽

取带有2~5 个不定芽的芽丛，转入生根培养基(M6: 1/2MS 基部培养基+NAA0.1 mg/L+香蕉100 g/L,pH 5.8)，培养成健壮的生根苗。待根长1 cm 时，即转入大棚炼苗，5 d 后，移入湿润栽培基质(椰糠: 河沙:园田土: 花生壳=2:1:1:1)，用500 倍甲基托布津淋透，然后遮阴保湿15 d 以上，带新根发出后，逐渐去除遮盖物。

致谢

感谢本课题组黄碧兰副研究员、李克烈副研究员及其它同事在工作上的支持。本研究由农业部物种资源保护项目(14RZZY-42)资助。

参考文献

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