桉树是桃金娘科（Myrtaceae）桉属（Eucalyptus）植物的统称。广泛分布于亚洲、南美洲和欧洲的一些地区，全球种植面积达二千万多公顷。桉树品种多，包括杂交品种有700多种，在这些品种当中有些品种具有重要的经济价值，如可作为纸浆、木材、纤维板材以及提取单宁和精油等原材料(祁述雄, 主编, 2002, 中国林业出版社, pp. 434-464 )，因此桉树具有广泛的开发利用价值，且具有速生，丰产，适应性强以及生产周期短等优点，目前已被多个国家和地区广泛种植。桉树人工造林面积已占世界人工造林面积的五分之一，截至2006年,全国桉树人工林面积已达到170万hm²，居世界第三位，仅次于巴西和印度(韦大器等, 2008；范春节等, 2008)。由于传统育种的局限性，一定程度上限制了桉树新品种的选育。进一步发展桉树抗虫、抗旱、抗冷等优良特征的新品种，尤其是对现有优良品系进一步的改造，转基因技术是一种行之有效且高效的技术，可弥补常规育种技术的不足，加速优质、高抗桉树新品种的选育进程(范春节等, 2008；Flachowsky et al., 2009；Valério et al., 2003；Chang et al., 2011；Zhang et al., 2010)。然而，转化体系依赖于高效稳定的再生体系，具有高效稳定再生率的再生体系成为发展桉树转基因技术的一大难题。

目前桉树再生存在的问题：(1) 再生率较低，难以进一步开展转化试验(王笑春等, 2006；谭德冠等, 2005；韦大器等, 2008；Lainé and David, 1994；Azmi et al., 1997)；(2) 以种子为基础，主要针对非杂交品系，难以推广应用(Subbaiah and Minocha, 1990；Huang et al., 2010)；(3) 对于杂交品系，以种子为基础，无法实现对现有优良品种的进一步的改良，并且杂交种子之间遗传变异较大，再生系统也存在较大差异(韦大器等, 2008；Barrueto Cid et al., 1999)。以上问题很大程度上制约了桉树转基因技术的进展。

对于我国广泛栽培的DH32-29、广林9号等杂交优良无性系，难以通过叶盘和茎段的愈伤组织获得再生或再生效率极低，无法获得较多数量的独立转化植株从而筛选出外源基因表达良好的株系(范春节等, 2008)。在此，我们以无性系无菌苗为材料来源，首次建立了尾巨桉(Eucalyptus urophylla × E. Grandis) DH32-29高效稳定的再生体系。

1结果与分析

1.1愈伤组织的诱导

为了诱导愈伤组织，将白化苗茎切段3-6mm接种到CIM1至CIM4培养基上。在含CIM和CIM2的培养基中，10天后，切口处陆续有愈伤组织长出，从暗处到弱光下，愈伤组织由黄白色逐渐变成淡绿色，少部分为粉红色，结构致密，整体呈哑铃状，外植体无褐化，愈伤组织诱导率高，均达到100%（表1）。而在CIM3和CIM4培养基中，愈伤组织诱导相对较慢，15天左右伤口处有愈伤组织形成，愈伤诱导率低，分别为75.74%和65.30%（表1），愈伤呈淡黄或淡绿色，结构致密，部分外植体褐化死亡，且在CIM4培养基中易诱导根的形成。结果显示，TDZ和CPPU易诱导茎段愈伤的形成，且质地好，而Zt和KT诱导愈伤缓慢，容易引起外植体褐化，并且KT易诱导根的形成，一旦形成了根则很难进一步诱导芽的形成。

1.2不定芽的诱导

在愈伤诱导培养基上培养21天的愈伤组织转接到含0.5 mg·L^-1 BA和01 mg·L^-1 NAA的B5培养基上进行不定芽的诱导，不同激素组合诱导的愈伤组织影响不定芽的形成存在显著差异，CIM2培养基诱导的愈伤组织不定芽诱导率最高，达83.42%，而CIM6不定芽诱导率只有0.91%（表2）。

从形态来看，10天左右，在CIM1和CIM2培养基中的愈伤组织开始起始器官发生，有红色芽点从茎段两端愈伤处冒出，而出芽高峰在14-21天。芽数多，50天平均芽数分别达4.3和5.8每个愈伤组织（表2）。在CIM2上诱导的愈伤组织诱导的不定芽叶子比较肥厚。在CIM3和CIM4培养基中的愈伤组织诱导的芽数较少，且愈伤组织褐化严重。

1.3不定芽伸长及生根培养

包含不定芽的愈伤转接到含0.2 mg·L-1 BA和0.02 mg·L-1的B5培养基中进行芽伸长培养，20天左右陆续有不定芽伸长至2 mm以上。大于2 mm的芽，切后转移到含0.5 mg·L-1 IBA的1/2MS培养基中进行生根诱导，10天后陆续有根发起，25天统计生根结果，平均生根率达92.17%。

2讨论

我们建立的桉树再生体系主要包括：快繁体系的建立、白化苗的制备、愈伤组织的诱导、不定芽的诱导、芽伸长和生根培养过程（图1所示）。

目前，国内外对桉树再生的研究，主要以种子为基础(Subbaiah and Minocha, 1990；Huang et al., 2010；谭德冠等, 2005)，对于杂交品系来说，种子之间存在较大差异，不能保障遗传稳定性；而对于已经广泛应用的桉树优良杂交品系，更是无法通过种子苗作为外植体来建立其再生体系。本体系以2-3年生桉树的枝条，建立快繁体系，再利用无性系无菌苗制备白化苗，保证了材料的供给、材料来源的均一性。生根苗在含5%蔗糖的MS无激素培养基中，黑暗条件促生的白化腋芽茎段切段，这种白化茎段很大程度上减少了外植体在愈伤诱导阶段的褐化，尤其对于易褐化的桉树品种，具有明显的改良效果。

桉树愈伤组织诱导激素的报道, 主要是关于不同浓度的6-BA和IAA 、IBA、NAA激素组合对桉树外植体进行愈伤组织诱导及不定芽诱导的再生试验，再生率低(卜朝阳, 2004；王笑春等, 2006；谭德冠等, 2005；Mullins et al., 1997；Azmi et al., 1997)。本实验室也对这些激素组合作一系列实验，表现出很低的再生率，且重复性差，外植体易褐化（结果未列出）。本文用TDZ、CPPU、KT和Zt对桉树愈伤诱导的效果进行了试验，结果表明TDZ和CPPU明显优于其他激素，尤其以后者更佳，再生率有明显提高。

本文以白化苗茎段为外植体，通过愈伤组织诱导和芽诱导，建立了桉树优良杂交品系尾巨桉DH32-39高效稳定的离体再生体系，愈伤诱导率为100%，芽诱导率达83.42%，生根率为92.17%。同时我们以此再生体系，对广林9号等其他杂交优良品系的再生做了研究，同样具有较高的再生频率。我们所建立的再生体系，为后期转基因试验奠定了良好的基础。

3材料与方法

3.1植物材料与处理

桉树品系为优良杂交品系尾巨桉DH32-29。从广东省河源桉树林场砍伐2~3年生桉树，抽出的嫩枝条去除叶片经常规消毒，具体为75 %酒精中浸泡20-30秒，无菌水冲洗5次，0.1% HgCl₂溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗5次，滤纸吸干。对经消毒的枝条进行切段，每段1-2 cm带1-2个节，插入MS培养基暗培养10-13天，之后弱光下（光强200lx）诱导腋芽的萌发。萌发芽经芽繁芽离体培养再生途径，获得无菌生根苗。将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的若干个腋芽，接种在含蔗糖5%的MS培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养14-19天，温度(23 ± 2)℃。

3.2培养基成分和培养条件

愈伤诱导和不定芽诱导所用基本培养基为含3% (w/v)蔗糖和0.6%(w/v)琼脂粉的B5培养基(pH5.6)。培养基配制后经121°C高压灭菌20分钟后待用，植物生长调节物质经滤头（含孔径0.22μm的滤膜）过滤灭菌后加入。

3.2.1愈伤组织的诱导

取白化苗茎去除顶芽和潜伏芽，切段3-6 mm作为外植体。接种到愈伤组织诱导培养基（CIM），激素配比见表3，暗培养7天，再转移到弱光照培养14天，光照16 时/天，光照强度200 lx，培养温度(23 ± 2) ℃。

3.2.2不定芽的诱导

将获得的愈伤组织转接到含0.5 mg·L^-1 6-BA和0.1 mg·L^-1 NAA的芽诱导培养基（SDM），每隔21天继代培养，光照16时/天，光照强度3000lx，温度(23 ± 2) ℃。

3.2.3不定芽伸长及生根培养

诱导的不定芽转移到含0.2 mg·L^-1 BA和0.02 mg·L^-1 NAA的B5培养基中进行芽伸长培养，每隔21天继代一次。不定芽中长度大于2 mm的芽经切割转接到含IBA0.5 mg·L^-1的1/2MS培养基中进行生根诱导培养。培养条件是光照16时/天，光照强度3000lx，温度(23 ± 2) ℃。

统计数据用SPSS 软件分析, 以Duncan法评价差异的显著性，显著性水平α=0.05，小写字母表示差异显著。

作者贡献

孙长斌在该研究中负责试验的安排和操作以及论文的撰写，郭棣负责试验的安排和操作，张英兰教授在试验方案的制定和修改工作中给予了悉心指导。

致谢

中国科学院华南植物研究所李耿光教授在本实验试验方法中给予了精心指导，在此表示感谢。

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