水平基因转移(HGT)，又称横向基因转移或侧向基因转移(lateral gene transfer, LGT), 是指没有生殖关系的不同物种之间，或叶绿体、线粒体等细胞器之间，以及细胞器和细胞核之间DNA片段的流动(Ochman, 2001; 欧剑虹等, 2003; 李志江等, 2008)。线粒体基因HGT主要在高等植物之间(Chang et al., 2011; Stegemann et al., 2012)发生。最初的研究认为HGT很大程度上只在原核生物中发生，现在发现它也是真核生物基因组进化中的一个重要的力量(Won and Renner, 2003; Davis and Wurdack, 2004)。

大多数的陆地植物和藻类都含有GroupI或GroupII内含子(Hepburn et al., 2012)。GroupI内含子主要存在于细胞器(如线粒体等)、细菌及某些低等真核细胞中，如植物线粒体基因cox1内含子，此类内含子常含有HGT现象。研究发现几乎所有的寄生植物线粒体DNA都被GroupΙ内含子入侵，该内含子可能是由一种真菌转移到被子植物中，然后在植物间进行传播(Barkman et al., 2007)。cox1基因内含子可能编码一个核酸内切酶并促进其内含子的转移(Sanchez-Puerta et al., 2011)，但目前这个机制还只是推测，尚未有实验进行过验证。GroupII内含子也常见于细胞器(如线粒体等)及细菌中，如cox2、nad1基因内含子属于GroupII内含子(Keren et al., 2012)，大多数GroupII内含子不会自我剪接，它需要蛋白质剪接因子的帮助(Ahlert et al., 2006)。

锁阳是常见的中药和蒙药(岳鑫等, 2013; Liu et al., 2013)，常寄生于蒺藜科(Zygophyllaceac)白刺属(Nitraria L.)植物的根部。Sanchez-Puerta等(2011)提到锁阳cox1基因缺乏内含子但存在3'Co-conversion tracts(CCT)序列。研究表明3'CCT很大程度上是被子植物内含子发生转移的痕迹(Vaughn et al., 1995; Sanchez-Puerta et al., 2011)。但目前关于锁阳cox1基因内含子HGT现象的研究均未见报道。所以我们选取锁阳为实验材料，对锁阳的6个不同居群间cox1、cox2、nad1基因序列进行分析，旨在揭示锁阳不同居群间cox1基因内含子的存在情况和GroupI内含子参与水平基因转移的机制。

1结果与分析

1.1系统发育分析

锁阳的分类地位仍未明确，根据形态学和核基因SSU、线粒体基因LSU和叶绿体基因rbcL、atpB和matK的聚类分析表明，锁阳属在分子聚类系统中定位于虎耳草目(Nickrent et al., 2005)，而用叶绿体IR区基因聚类分析表明，锁阳在分子聚类系统中位于蔷薇目(Zhang et al., 2009)。我们使用MEGA5软件对线粒体cox1、cox2基因的内含子和外显子序列分别与NCBI数据库收录的相应基因序列构建聚类树(图1)。锁阳cox2基因内含子和外显子聚类结果相一致，均与十字花科的拟南芥属和芸薹属处于同一分支，与大戟属相近。而cox1基因的内含子与其外显子的聚类结果不一致，cox1基因外显子的聚类结果与cox2基因内含子和外显子的聚类结果相似，锁阳与大戟属相近。cox1基因内含子聚类结果显示，锁阳与寄生花属、素馨属处于同一分支，与天南星属相近，其中天南星属为单子叶植物。所以锁阳cox1基因内含子的系统发育关系与cox1外显子、cox2内含子和外显子的系统发育关系不一致。因此，cox1基因内含子聚类结果表明其内含子可能发生了转移。

1.2遗传距离比较分析

将锁阳6个不同居群间cox1、cox2、nad1基因各自的外显子与内含子平均遗传距离进行比较。结果如表1所示，cox1基因内含子与外显子序列平均距离值都为0，而cox2基因内含子与外显子序列的平均距离值较大，分别为254.9333和68.9333，nad1基因内含子序列的平均距离值为320.3333(值越小表示基因越保守，越大表示差异性越大)。利用NCBI的Blast在线对6个不同居群间cox1基因内含子序列进行两两同源性检索结果显示均为100%。

遗传距离的大小通常反映遗传多样性的高低，种内个体间遗传距离越小，彼此亲缘关系越近，则遗传多样性越低；反之，遗传距离越大则遗传多样性越高。由表1可知，锁阳6个不同居群间nad1基因内含子和cox2基因的内含子和外显子遗传距离较大，说明cox2和nad1基因的遗传多样性相对较高，在进化过程中其遗传变异性较大，进化较快；而cox1基因的内含子和外显子遗传距离小，说明其遗传多样性较低，该基因在进化过程中的遗传变异性小，进化慢，且6个不同居群间cox1基因的内含子如此高的同源性，表明该基因内含子可能具有功能。

1.3生物信息学分析

使用ExPASy-Translate Tool将锁阳线粒体基因cox1基因内含子序列(约900 bp)翻译成氨基酸序列，利用BLAST-protein blast在线对其进行同源性检索显示(图2)，cox1基因内含子氨基酸序列与楝科樫木属核酸内切酶、葫芦科西瓜属核酸内切酶、鼠李科马甲子属核酸内切酶、鼠李科欧鼠李核酸内切酶、 姜科舞花姜属核酸内切酶、姜科山柰属核酸内切酶、夹竹桃科玫瑰树属核酸内切酶的同源性分别高达96%、95%、94%、94%、94%、93%和94%，表明cox1基因内含子氨基酸序列与核酸内切酶序列(endonuclease)很相似。

使用Pfam数据库进行比对，发现有两个Pfam-A matches (有意义链)与cox1基因内含子氨基酸序列序列相匹配，分别为LAGLIDADG-1 (Clan: CL0324; Envelope: 52-141; Alignment: 52-140; HMM: 1-101; HMM length:102; Bit score: 47.3; e-value: 2.3e-12)和LAGLIDADG-1 (Clan: CL0324; Envelope:;158-249; Alignment: 158-245; HMM: 1-98; HMM length: 102; Bit score: 36.1; e-value: 6.9e-09)，都属于LAGLIDADG endonuclease。Pfam数据库分析表明cox1基因内含子氨基酸序列都与核酸内切酶相匹配。因此认为，锁阳cox1基因内含子很有可能编码核酸内切酶。

1.4 3'Co-conversion tracts (3'CCT)分析

一般认为同源内含子很有可能发生转移，由于该位点常常编码DNA核酸内切酶，能促进内含子的转移，途径为：若转移来的序列为含有内含子的基因序列，该内含子编码核酸内切酶，则核酸内切酶识别并剪切不含内含子的同源序列，通过双链断裂修复途径，以含内含子基因序列为模版，在连接酶和解离酶帮助下，完成双链修复，在DNA修复复制时, 内含子两侧的外显子的部分序列也常常被复制到受体DNA中，这部分外显子称为Co-conversion tracts (CCT) (谢君等, 2001; Sanchez-Puerta et al., 2011) (图3)。且3'CCT很大程度上是被子植物内含子发生转移的痕迹(Vaughn, 1995; Sanchez-Puerta, 2011)。我们将cox1基因古老序列、欧洲锁阳和锁阳6个不同居群的部分序列(内含子上下游的部分外显子)进行对比(图4)。结果显示6个不同居群锁阳cox1基因均含有内含子和3' CCT，长度为35 bp，且古老被子植物序列不含内含子和3'CCT，表明其内含子可能携带部分外显子序列发生了水平基因转移。

1.5 cox1内含子RT-PCR分析

提取锁阳总RNA，利用紫外分光光度计检测其OD260与OD280的比值为1.86，浓度为297.1 ng/μL，说明RNA纯度较高，可用于后续实验(图5)。以cox2基因内含子为模版设计引物对cox2iF和cox2iR：以DNA为模版，扩增条带约1 400 bp，与该引物所对应的cox2基因序列长度一致；以cDNA为模版，没有扩增出序列，一方面说明cox2基因在反转录成为mRNA的过程中内含子被剪切了，另一方面也证明本实验所使用RNA样品较纯，无DNA污染。因此，该RT-PCR实验中cox2基因的扩增结果可以作为一个对照。

此外，我们在cox1基因外显子处设计引物对cox1eF和cox1eR (图3; 表2)，以DNA为模板，扩增序列长度约1 250 bp，与该引物所对应的cox1基因序列长度一致；以cDNA为模版，扩增序列约350 bp序列，这说明反转录过程中内含子被剪切，扩增出的350 bp产物为剪切后剩余的外显子序列。在cox1基因内含子处设计引物对cox1iF和cox1iR，以DNA为模版，扩增条带长约480 bp，与该引物所对应的cox1基因序列长度一致；以cDNA为模版，扩增条带长约480 bp，说明该引物所包含的cox1基因内含子可以转录mRNA。再用上游引物位于cox1基因外显子区域，下游引物位于内含子区域的引物对cox1eF和cox1iR (图3; 表2)，以DNA为模版，扩增条带约800 bp，与该引物所对应的cox1基因序列长度一致；以cDNA为模版没有扩增出序列，说明cox1基因内含子部分被剪切掉了，下游引物没有结合上去，所以无扩增产物，说明cox1基因内含子转录的mRNA并不与外显子相连，应该是独立转录。

根据RT-PCR结果，cox1基因内含子可以转录mRNA，并比外显子的扩增条带亮，说明内含子在表达量上与外显子存在差异，更进一步证明cox1基因外显子和内含子的转录是两个独立的过程。我们对扩增出的cox1基因内含子的cDNA进行测序，结果显示它与NCBI数据库中存在的cox1基因内含子序列一样，该结果符合先前的生物信息学预测，即cox1基因内含子可以独立转录mRNA，且很有可能编码具有功能的核酸内切酶。

2讨论

植物线粒体基因组发生水平基因转移是非常普遍的，其中发生最多的是GroupI内含子的转移(Cho and Palmer, 1999; Sanchez-Puerta et al., 2011)。因此线粒体基因cox1内含子的转移现象更成了研究热点。Cho和Palmer (1999)将单子叶植物天南星科(Araceae) 14个属的cox1基因通过Southern杂交技术进行分析，发现6个属的cox1基因中含有GroupI内含子，通过进化树分析表明这6个属的内含子是通过水平转移得到的。

本研究对锁阳cox1、cox2、nad1基因内含子和外显子序列进行了聚类分析，聚类结果表明cox1基因内含子与其系统发育关系不一致，说明cox1基因内含子可能存在转移现象。基因进化速率具有不均一性，与相邻的外显子相比，内含子更容易发生碱基替换(Laroche et al., 1997)。内含子序列在进化过程中变异程度非常高，要高于外显子，由于其不受选择压力作用或选择压力小(欧剑虹等, 2003)。6个不同居群cox1基因的内含子具有如此高的同源性，可能与其内含子具有功能相关。

生物信息学分析预测，该内含子有可能编码核酸内切酶。Vaughn等(1995)表明草胡椒属cox1基因内含子可能是通过水平基因转移从真菌获得。核酸内切酶催化内含子的整合，识别目标序列，通过双链断裂修复途径，3' CCT序列也常常被复制到受体DNA中(谢君等, 2001)，成为被子植物内含子发生转移的痕迹(Vaughn et al., 1995; Sanchez-Puerta et al., 2011)。Cho等(1998)和Cusimano等(2008)研究表明cox1基因标准的3' CCT长度为3~21 bp，而Sanchez-Puerta等(2011)对此提出了质疑，他们认为锁阳3' CCT的最小长度为35 bp，欧洲锁阳的3'CCT的最小长度为78 bp，古老被子植物cox1基因无3' CCT序列。而本实验3'CCT检测表明6个不同居群锁阳cox1基因均存在3' CCT序列，且3' CCT序列长度均为35 bp，说明锁阳cox1基因的内含子序列和部分外显子序列很可能是从外源转移而来的，且Sanchez-Puerta等(2011)研究表明锁阳cox1基因不含有内含子，古老被子植物cox1基因也无内含子，而我们的结果表明锁阳cox1基因存在内含子，说明锁阳cox1基因可能处于转移的过程中。RT-PCR实验结果显示内含子可以转录mRNA，因此锁阳cox1基因内含子很可能编码一个核酸内切酶，该核酸内切酶很有可能促进了其内含子的转移。

3材料与方法

3.1材料

本实验所用的锁阳分别采自内蒙古自治区阿拉善盟额济纳旗(101.07'E, 41°97'N)和鄂尔多斯市杭锦旗(108.74'E, 39°84'N)、青海省海西蒙古族藏族自治州(93.37'E, 37°38'N)、宁夏回族自治区石嘴山市平罗县(106.55'E, 38°91'N)、甘肃省武威市民勤县(103.92'E, 38.67'N)和蒙古国南戈壁省Ummugobiaimag (42°24′6″E, 107°34′1″N )6个居群，风干后-80℃储存。

3.2方法

3.2.1锁阳总DNA提取

使用TIANGEN Plant Genomic DNA kit。

3.2.2 PCR及测序方法

在梯度PCR仪上完成聚合酶链式反应(PCR)。反应总体积25 μL，加入TaKaRa LA TaqTM高保真酶扩增。反应体系如下：cox1基因：H₂O 12 μL、Buffer 2.5 μL、dNTP 4 μL、Forward primer 2 μL、Reverse primer 2 μL、DNA2 μL、LA Taq 0.5 μL。94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸2.5 min，35个循环；72℃保温10 min。nad1、cox2基因：H₂O 12 μL、Buffer 2.5 μL、dNTP 4 μL、Forward primer 2 μL、Reverse primer 2 μL、DNA 2 μL、LA Taq 0.5 μL。94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃保温10 min。引物见表2。PCR扩增的产物经纯化后由上海英潍捷基有限公司进行测序。

3.2.3锁阳总RNA提取、纯化及检测

使用TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit (多糖多酚植物总RNA提取试剂盒)提取锁阳总RNA，TIANGEN RNAclean Kit及DNaseI纯化RNA。利用分光光度计进行RNA定量及纯度检测，利用甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

3.2.4反转录实验(PT-PCR)

采用TAKARA PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser去除基因组DNA，反应条件：42℃ 2 min，4℃保存。然后以RNA为模版反转录为cDNA，反转录反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。再以cDNA为模板扩增目的片段，引物见表2，反应体系：H₂O 13 μL、Buffer 2.5 μL、dNTP 4 μL、Forward primer 2 μL、Reverse primer 2 μL、cDNA1 μL、LA Taq 0.5 μL，反应总体积25 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸2.5 min，35个循环；72℃保温10 min。

3.3序列分析方法

3.3.1系统发育进化分析

使用杭锦旗锁阳DNA为模版，引物cox1F和cox1R扩增cox1基因序列(含内含子序列)；引物cox2iF和cox2iR扩增cox2内含子基因序列；引物cox2eF和cox2eR扩增cox2外显子基因序列。测序所得的cox1、cox2、nad1基因序列用BLAST：Basic Local Alignment Search Tool进行比对。从NCBI数据库中选取具有代表性植物的cox1、cox2基因序列(图1)，利用ClustalX将序列进行对齐，参数设置使用默认值(Thompson et al., 1997)，使用MEGA5软件最大似然法(maximum likelihood tree)构建系统发育树(蒙姣荣等, 2014)，参数bootstrap值设置为1 000 (Felsenstein, 1985)。

3.3.2遗传距离比较分析

使用cox1F和cox1R，cox2iF和cox2iR，cox2eF和cox2eR，nad1F和nad1R四对引物扩增锁阳6个居群的cox1、cox2、nad1基因。使用ClustalX软件分别将锁阳6个居群的cox1、cox2、nad1三个基因的内含子和外显子序列进行对齐，使用MEGA5软件分别对6个居群的3个基因内含子和外显子序列进行整体平均距离(compute overall mean distance)预测，分析三个基因的变异程度。

3.3.3生物信息学分析

使用ExPASy-Translate Tool (http://www.expasy.org/tools/dna.html)在线对cox1基因内含子序列进行翻译，利用BLAST在线对其进行同源性检索，ClustalX对比，BoxShade着色，使用Pfam在线对其功能结构域进行预测。

3.3.4 3'Co-conversion tracts (CCT)分析

参照Sanchez-Puerta等(2011)方法，对cox1基因古老序列、欧洲锁阳(Cynomorium coccineum)和锁阳6个不同居群间cox1基因的内含子及内含子邻近的部分外显子序列进行3' CCT分析。

作者贡献

苏小娟是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析和论文初稿的写作；刘广达参与实验设计和论文的修改；刘英和冯晓宇参与部分实验分析和论文修改；陈贵林是本项目负责人，负责实验设计和论文修改及定稿。全体作者均已阅读并同意提交本稿。

致谢

本研究由国家自然科学基金(31260117)和国家科技支撑计划课题(2011BAI07B07)共同资助。

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