在这些植物中圣罗勒(OS)在许多亚洲、非洲和南美洲国家的本土的医学体系中占重要地位。此前，已有许多学者报道了圣罗勒(OS)的抗菌性能(Ahmad et al., 1998; Ahmad and Beg, 2001; Mishra and Mishra, 2011)。植物化学分析显示，圣罗勒(OS)的抗菌性能是由于其体内含有苷类、酚类和鞣质物质(Ahmad and Beg, 2001)。

除了这些行之有效的药材，还有一些野草因其毒性而出名，如蓟罂粟（AM）。有少量报告表示，蓟罂粟（AM）的种子和叶子也有抗菌活性(Kempraj and Bhat, 2010)。

基于以上原因，本研究欲探索不同圣罗勒(OS)和蓟罂粟(Am)叶提取物对两种常见家禽病原体的体内外抗菌活性，即，鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26。

1结果与分析

1.1纸片扩散法测定不同圣罗勒(OS)叶提取物的体外抗菌效果

检测了圣罗勒(OS)叶提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26两种细菌的抗菌活性。应用4种不同的制剂提取圣罗勒(OS)叶中的物质，分别是冷水、热水、甲醇和甲醛；每种提取物分别设置成4种浓度，即2 mg/片、5 mg/片、10 mg/片和20 mg/片。试验重复三次，取平均值（表1、表2）。抗菌活性呈浓度依赖性。所有2 mg/片浓度的提取物对分离的细菌都无显著的抗菌效果，然而所有20 mg/片浓度的提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26两种细菌菌落的生长都有最大的抑制作用。在所有的提取物中甲醇提取物表现出最好的抗菌效果，对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26分别产生了20 mm和18 mm的抗菌区域。所有提取物对大肠杆菌O26的抗菌作用都比对鼠伤寒沙门菌的小（图1）。试验显示，在10 mg/片浓度提取物的抑制作用区域内，存在有抗性的细菌菌落。且，在长时间的抑制作用下，提取物的抑制作用逐渐减小。

表 1 圣罗勒(OS)叶热水、冷水提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26的体外抗菌效果 Table 1 Effects of cold and hot aqueous extract of OS leaves against S. enterica serovar Typhimurium and E. coli O26

表 2 圣罗勒(OS)叶甲醇、甲醛提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26的体外抗菌效果 Table 2 Effects of methanolic and hydromethanolic extracts of OS leaves against S. enterica serovar Typhimurium and E. coli O26

 

 

图 1 圣罗勒(OS)叶甲醇提取物对两种细菌的体外抗菌效果 Figure 1 In vitro Antibacterial effects of methanolic extract of O. sanctum leaves against two bacterial species

 

1.2纸片扩散法测定不同蓟罂粟(Am)叶提取物的体外抗菌效果

也对蓟罂粟(AM)叶提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26两种细菌的抗菌活性进行了检测。用冷水、热水、甲醇和甲醛4种不同的制剂提取蓟罂粟(AM)叶中的物质，检测每种提取物在2 mg/片、5 mg/片、10 mg/片和20 mg/片四种浓度下的抗菌活性，试验重复三次，取平均值（表3、表4）。2 mg/片浓度的冷水和热水提取物对两种细菌都没有任何抗性。5 mg/片浓度的蓟罂粟(AM)叶提取物对两种细菌只有非常狭窄的抑制区，只持续了24~36小时，然后就在之前的抑制区域出现了鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26的菌落。20 mg/片浓度的蓟罂粟(AM)叶提取物对两种细菌表现出了最大的抑制区域。本试验也表明甲醇提取物对两种细菌有最好的抗菌作用（图2）。

表 3 蓟罂粟(AM)叶热水、冷水提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26的体外抗菌效果 Table 3 Effects of cold and hot aqueous extract of AM leaves against S. enterica serovar Typhimurium and E. coli O26

 

 

表 4 蓟罂粟(AM)叶甲醇、甲醛提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26的体外抗菌效果 Table 4 Effects of methanolic and hydromethanolic extracts of AM leaves against S. enterica serovar Typhimurium and E. coli O26

 

 

图 2 蓟罂粟(AM)叶甲醇提取物对两种细菌的体外抗菌效果 Figure 2 In vitro Antibacterial effects of methanolic extract of A. mexicana leaves against two bacterial species

 

1.3圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)热水叶提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26的体内抗菌作用

1.3.1测定ID50剂量的鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26对鸡的影响

ID50剂量的鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26分别为1.68×109 CFU/ml和6.75×109 CFU/ml。当鸡表现出发热、迟钝、抑郁、腹泻、羽毛凌乱、拒绝喂养和死亡时被认为是受感染的。从感染鸟和死鸟内分离、验证两种细菌。

1.3.2向被ID50剂量的鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26感染了的试验鸡喂食圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)热水叶提取物，试验鸡的变化情况

圣罗勒(OS)喂养组有83%的试验鸡免于被鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26感染，而蓟罂粟(AM)喂养组有66%的试验鸡免于被感染，因为它们没有表现出疾病症状（表5）。

圣罗勒(OS)热水提取物能更好地清除、抑制鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26，蓟罂粟(AM)热水提取物抑菌效果没有圣罗勒(OS)好，但优于对照组（表6、图3、图4）。

用被喂食了ID50剂量1.68 X 109 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌和6.75×109 CFU/ml的大肠杆菌的试验鸡对圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物的体内抗菌活性进行检测（表5）。发现被喂食了圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物的鸡得到了更多的保护，与对照组相比没有出现临床症状。被喂食了提取物的试验鸡与对照组的鸡体内血液的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌含量每到第24、48、72小时要进行对比。被喂食了圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)的试验鸡血液中鼠伤寒沙门氏菌的浓度在所有试验阶段中都比没喂食的鸡浓度低（表6、图3）。大肠杆菌O26的试验结果与此相似。这说明用圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物喂食的鸡对细菌有更好的抵抗作用。

以上试验结果表明圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌有抗菌活性。

表 5 试验鸡体内测定圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O26的体内抗菌效果 Table 5 In vivo antibacterial effects of HAE of OS and AM leaves against S. enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli O26 infection in chickens

 

 

表 6 试验鸡喂食圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物后血液细菌负载量的检测 Table 6 Determination of bacterial load in blood of OS and AM fed chickens

 

 

图 3 圣罗勒(OS)、蓟罂粟(AM)叶热水提取物在试验鸡体内对鼠伤寒沙门菌的抗菌效果（血液载菌量）比较 Figure 3 Line diagram showing the antibacterial effect of HAE of OS and AM leaves against S. enterica serovar Typhimurium in blood of fed and unfed chickens

 

 

图 4 圣罗勒(OS)、蓟罂粟(AM)叶热水提取物在试验鸡体内对大肠杆菌O26的抗菌效果（血液载菌量）比较 Figure 4 Line diagram showing the antibacterial effect of HAE of OS and AM leaves against E. coli O26 in blood of fed and unfed chickens

3材料与方法

3.1用索氏提取器制备热水、甲醇和甲醛提取物

印度马图拉的BSA大学植物系对圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)两种植物进行了鉴定。在马图拉大学校园及周边地区收集圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶片。鲜叶在树荫下阴干后用于制备热水提取物（HAE）、冷水提取物（CAE）、甲醇提取物（ME）和甲醛提取物（HME）。体外抗菌性能的测定需要做所有的准备工作，而体内抗菌试验只需要用热水提取圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)的叶片。

将59g圣罗勒(OS)/蓟罂粟(AM)叶的干粉放置在萃取器的多孔渗透滤纸筒上，下面放置一个装有750毫升溶剂（TDW/甲醇/甲醛）的烧瓶。烧瓶被加热，溶剂被蒸发掉。温度是根据各自的溶剂（TDW/甲醇/甲醛）的沸点调节的。提取过程需要持续15~20个循环，并取出含有溶剂和提取物的烧瓶。将烧瓶中的溶剂蒸发掉，并测定剩余物质。

3.2用干燥叶制备圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)的冷水提取物

在室温下，将150 g干叶粉浸泡在750毫升的三重蒸馏水四天。添加2至4滴的氯仿，以防止真菌的生长。将浸泡的混合液每天摇晃3次，4天后先后用棉布、1张定性滤纸和0.45 μm的膜滤器对其进行过滤。将滤液中的水份蒸发掉，然后冻干；将提取出来的物质称重，4ºC保存以备后用。

3.3菌株

由印度马图拉DUVASU的微生物学和免疫学系提供鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O26。这两种细菌被用于检测圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物的体内/外抗菌活性。

3.4试验鸡

由马图拉Uday孵化场购买均一的、无病的、一天大的小鸡，并饲养在DUVASU的家禽饲养场。所有的鸡都在标准统一的条件下被安置和喂养。为了防止环境污染，采取了预防措施。在每个试验组内，用翼标签帮助识别各个鸡个体。本试验采用七日龄雏鸡。所有试验均通过了“实验动物伦理委员会（IAEC）”的批准，并在他们的指导下进行试验。每个试验组合对照组均用6只试验鸡。

3.5确定圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物（HAE）的无毒剂量

圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物（HAE）的无毒剂量从三个口服剂量250 mg/kg、500 mg/kg和1000 mg/kg中选择。在体内抗菌活性试验中，250 mg/kg的剂量是圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物（HAE）使用的最佳剂量（Varshney et al., 2013）。

3.6制备包含不同浓度的圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物的草药纸片/草药盘

采用直径为6 mm的Whatman 1号滤纸，将其于160℃高温的空气中灭菌60分钟。然后用滤纸片沾染不同浓度的圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物，将其干燥后即可成为备用的草药纸片/盘。制备分别含有由冷水、热水、甲醇和甲醛溶液提取的圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物的草药纸片，每种提取液又分别包含2 mg、5 mg、10 mg和20 mg四种浓度。这些草药纸片/盘将用于测试圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O26的抗菌活性。

3.7测定不同叶提取物的体外抗菌活性

采用纸片扩散法(Bauer et al., 1966)。0.5 ml的分离后的菌落培养液均匀地分布于板中，菌液浓度为3×104 CFU/ml。包含有2 mg、5 mg、10 mg和20 mg浓度的圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物草药纸片被放置于8~10cm的已接种菌落的营养琼脂板上，在37℃培养48小时。测定草药纸片上抑菌区域的直径大小来表示提取物的抗菌活性，其测定单位为mm。每个试验重复3次。

3.8测定圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶提取物对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O26的体内抗菌活性

3.8.1探索圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物喂食试验鸡的无毒剂量

用口服的方法喂食试验鸡圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物。圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物都设置250 mg/kg(试验鸡体重)、500 mg/kg(试验鸡体重)和1000 mg/kg(试验鸡体重)三个喂食剂量，再设置一个喂食三重蒸馏水做安慰剂的对照组，喂食21天。结果发现，3种剂量中250 mg/kg是最理性的(Varshney et al., 2013)，将其用于体内抗菌活性的研究。

3.8.2确定鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O26的试验鸡喂食剂量ID50

将生长于贝尔塔尼(LB)琼脂板上纯的鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O26的光滑菌落接种于LB肉汤中。接种后的LB肉汤放置于37℃培养过夜，然后于3000 rpm的转速下离心10分钟。舍弃上清，用PBS洗涤细胞沉淀3次，并最终重新悬浮在PBS溶液中，用McFarland的浊度计分别配制浓度为9×109细胞/ml的鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O26 PBS悬浮液。稀释两次，然后将1ml稀释了4倍的悬浮液喂食给试验鸡，每组包含6只鸡。口服接种所有的试验鸡后，观察10天，每天观察2次，监测其临床症状如发热、迟钝、抑郁、腹泻、羽毛褶皱、和拒食而死亡。从受感染者和死鸡中分离并确认了各自的细菌。ID50的剂量用Reed and Muench (1938)的方法计算得来。

3.8.3圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物对感染ID50剂量的鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O26的试验鸡的影响

圣罗勒(OS)和蓟罂粟(AM)叶热水提取物对剂量为ID50的鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O26的体内抗菌效果由临床症状和血液细菌负荷量确定。设置了6组试验鸡，组1~组6（GI~VI），每组6只鸡。GII和GIII喂食剂量为250 mg/kg的圣罗勒(OS)热水提取物21天；GV和GVI喂食剂量为250 mg/kg的蓟罂粟(AM)热水提取物21天；GI和GIV喂食安慰剂(三重蒸馏水)，做对照。第22天，GI、GII和GIII接种1.68×10⁹ CFU/ml (ID₅₀剂量)的鼠伤寒沙门氏菌；GIV、GV和GVI接种6.75×10⁹ CFU/Ml (ID₅₀ 剂量)的大肠杆菌O26，接种方式为口服。检测临床感染症状10天，每天观察2次。

3.8.4测定血液中的细菌负荷量

于第23、24和25天分别从每组中选取3只试验鸡放血。将收集的血连续稀释10倍，每组稀释后的血液命名为10^-1~10^-6。将0.5 mL 10^-5和10^-6的血液稀释液接种于LB琼脂板上，每份血液稀释液接种3板，接种时采用无菌的接种环/棒，接种后于37℃培养。24 h后记录细菌菌落数量(CFU)并求平均值。

作者的贡献

所有作者对这项研究都做出了同样的贡献。所有的作者阅读并同意了文章的最终版本。

致谢

本人对于本校能提供开展这项研究工作的必要设施非常感谢。

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