红景天为景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)植物，为多年生草本或亚灌木，全世界有96种，我国73种，多分布在北半球的高寒地带，是珍稀的药用植物，有“高原人参”、“东方神草”、“雪山仙草”的美誉。现代药理学研究表明红景天具有抗氧化、抗辐射、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤、抗缺氧、抗疲劳、增强免疫、增强脑机能改善学习记忆、改善心血管系统功能、保护器官免受自由基损伤等多方面药理作用(刘明成和张得钧, 2013)，是一种极具开发前景的环境适应药物，近年来备受关注。

洮河红景天为红景天属的植物，为中国的特有植物。分布于我国的甘肃、青海等地，生长于海拔2 600~3 000 m的河谷阳坡及山崖地区，以根茎入药，其味涩、性寒、无毒；具有止血化瘀、调经、固涩、清热、壮阳、退烧、解毒、防瘟等功效，主治跌打损伤、肾虚腰痛、吐血、崩漏、肺炎发烧、腹泻、四肢肿胀、月经不调、痢疾、抗缺氧等病症(中国科学院西北高原生物研究所, 1991)。

叶绿体DNA (cpDNA)在被子植物中为母系遗传，具有基因组小，在分子水平上差异明显、编码区与非编码区序列进化速率不一致，trnS-G是常见的非编码区cpDNA片段，叶绿体编码丝氨酸转运RNA的trnS基因和编码甘氨酸转运RNA的trnG基因之间的trnS-G间隔区，进化速率快，不同类群可以使用通用引物，在属下种间以及近缘属间的系统发育关系研究中已开始得到应用(Palmer and Herbon, 1988; 田欣和李德铢, 2002)。红景天苷为红景天的一种次生代谢产物，是红景天发挥药理作用的重要活性成分(李婷等, 2011; 覃华等, 2011; 许晗等, 2011)。近年来，对红景天苷形成途径的认识也不断深入(Li et al., 2001; Ma et al., 2007; 2012)，但对红景天苷形成与积累分子机制的相关研究并不多，本文旨在分析不同洮河红景天植株trnS-G基因多态性与红景天苷含量变异的规律，为揭示红景天苷形成与积累的分子机理奠定基础，对红景天资源的充分利用和保护有重要的现实意义。

1结果与分析

1.1 trnS-G扩增

从图1可以看出扩增得到的片段大小在750 bp左右，与NCBI下载的同源序列长度基本一致，同时通过电泳检测发现，扩增得到的产物特异性比较强，可以进行后续测序工作。

1.2 trnS-G序列特征分析

不同采样地的洮河红景天植株trnS-G基因序列存在多样性。所扩增得到目的序列长度在597~600 bp之间，碱基组成频率见表1，T、G、C、A的平均频率为36.7%、16.4%、32.1%和14.8%，各序列差异不大。trnS-G序列主要存在以下3种突变情况：(1)单核苷酸多态性：洮河红景天trnS-G基因共有11处单核苷酸多态性，ZDJ1203样品在53 bp处存在T-C，92 bp处存在G-A的颠换；ZDJ1209/ZDJ1210样品在336 bp处存在T-G的转换；ZDJ1211样品在123 bp处存在T-G的转换，288 bp处存在G-A的颠换。(2)插入/缺失突变：ZDJ1203样品在231 bp处存在1个碱基T的插入；ZDJ1211样品在231~232 bp的位点上存在TT两个碱基的插入；ZDJ1212样品在301 bp处存在1个碱基A的缺失。(3)倒位突变：ZDJ1212样品在466~467 bp位点上存在(AG-GA)的倒位和469~470 bp位点上存在(AT-TA)的倒位。

1.3 trnS-G序列的多态性及聚类

从表2可知，8份样品材料中trnS-G部分基因片段可分为下列单倍型：H1单倍型(CATTGAGAGATGT单倍型)：该单倍型有1份样品材料包括：ZDJ1203占12.5%。H2单倍型(TGGTTAAGAGATTG单倍型)：该单倍型有1份样品材料包括：ZDJ1211占12.5%。H3单倍型(TGTGATAGATTG单倍型)：该单倍型共2份样品材料包括：ZDJ1209和ZDJ1210占25%。H4单倍型(TGTGAGAGATTG单倍型)：该单倍型共3份样品材料包括：ZDJ1213、ZDJ1214和ZDJ1215占37.5%。H5单倍型(TGTGGGATATG单倍型)：该单倍型有1份样品材料包括：ZDJ1212占12.5%。其中，H3、H4单倍型占62.5% (5/8)，这两个单倍型仅有1个碱基的差异。H1、H2、H5单倍型所占比例较小，各占12.5%。

1.4 trnS-G序列的多态性与地理来源相关性分析

8份红景天样品来源于3个不同采样地，实验结果显示，trnS-G序列在不同地区存在多态性。采集于同德县河北乡峡谷的洮河红景天样品有3种单倍型分别为H2、H3和H5型；青海湖南山的3株洮河红景天样品仅有H4一种单倍型；大通宝库的洮河红景天样品仅有1株，为H1单倍型。据以上分析，trnS-G单倍型分类和地理分布有相关的趋势，如H4单倍型仅仅在青海湖南山采集的样品中存在；每一种单倍型对应一个采样地。

1.5红景天苷含量测定

采用高效液相色谱法测定不同洮河红景天植株根中红景天苷含量，检测结果表明(图2; 图3; 图4)：不同地区洮河红景天植物中红景天苷的含量具有明显的差异，含量最高的是青海湖南山的ZDJ1215个体，最低的有5个个体：分别是大通宝库的ZDJ1203、同德河北乡峡谷的ZDJ1209、ZDJ1210、ZDJ1211以及青海湖南山的ZDJ1213；同时同一地区不同个体之间红景天苷的含量也存在一定的差异，具体结果见表3。

1.6 trnS-G基因的多态性与红景天苷含量相关性分析

采通过对叶绿体DNA片段trnS-G基因的多态性与红景天苷含量进行相关性比较得出单倍型和红景天苷含量相关性结果(表4)。

根据表4的统计结果，8个样品中，trnS-G基因的部分片段可分为5个单倍型。其中H1、H2、H3单倍型对应的样品均未检测到红景天苷的存在。H4号、H5单倍型样品中检测到红景天苷的积累，H4单倍型样品的平均含量为0.18%，H5单倍型仅有1个样品，含量为0.2%。由表4可知，H3与H4单倍型仅有1个碱基之差，但红景天苷含量却有显著差异；样品ZDJ1213、ZDJ1214和ZDJ1215为同一种单倍型，但红景天苷含量也存在明显差异。

2讨论

基因与活性成分含量是否相关很大程度上可能取决于所选基因，只有当反映活性成分含量的基因与其相对应的活性成分同步进化时，基因才能反映出活性成分含量的变异，因此，研究调控活性成分的基因多态性能在更很大程度上反应活性成分的变化。但一般情况下，功能基因较长，如果直接作为指标会有一定困难，可以通过叶绿体DNA、核糖体DNA等通用基因间接寻找与活性成分含量密切相关的基因，从而为活性成分含量变异的基因机制的探讨奠定基础(刘春生, 2006)。

基于此，本文选择叶绿体DNA (cpDNA) trnS-G序列，探讨洮河红景天trnS-G序列与红景天苷含量变异的关系，研究结果表明，从地理分布来进行分析，洮河红景天cpDNA trnS-G的单倍型与地理分布有一定的相关性；从洮河红景天所含红景天苷的有无、多少进行分析，trnS-G序列的单倍型与红景天苷含量同样具有相关性，说明洮河红景天红景天苷的含量既与地理分布有一定的联系，同时也与单倍型有关。近年来，国内外学者对基因与活性成分含量变异的相关性进行了研究，也得出了同样的结论。如de Meijer EP 等发现大麻有大麻酚型(CBD)，δ-9-四氢大麻酚型(THC)和混合型3个化学型，利用RAPD方法对3个化学型进行了分析，发现了化学型分类与基因分化相一致(de Meijer et al., 2003) ；通过对同一地点栽培的17株三年生三七中6种皂苷类活性成分进行分析发现，其中5株的皂苷含量具有明显的差异；进一步对其进行AFLP和ITS序列分析，发现AFLP比ITS序列能够提供到更多的遗传信息。AFLP分析的三七具有明显的遗传多样性，同时基因差异又进一步影响了三七的6种皂苷类成分含量(Hong et al., 2005)。通过对广著香的matK和18S基因序列进行分析，18S和matK基因分化与广藿香的化学型具有明显的相关性(刘玉萍等, 2002)；通过对金银花的5S-rRNA基因间区序列进行分析，金银花不同居群的5S-rRNA基因间区序列存在一定的分化，说明5S-rRNA基因间区序列变异可能和金银花的质量变化相关(李萍等, 2001)；通过对不同产地浙贝母生物碱含量与5S-rRNA基因间区序列的相关性进行分析，来源于不同产地的浙贝母5S-rRNA基因间区序列相同，虽然其总生物碱含量和组成相同，但总生物碱不同单体的含量差别较大，认为浙贝母化学成分的变异可能与由其生境有关(蔡朝晖等, 2001)。

3材料与方法

3.1材料

从采集青海不同地区的野生红景天植株，经中国科学院西北高原生物研究所杨永昌教授，鉴定为洮河红景天(Rhodiola taohoensis S. H. Fu)，凭证标本保存于青海大学。采集植物的新鲜叶片和根，叶片经硅胶快速干燥，根晾干后备用，实验材料采集地点见表5。

3.2样品DNA的提取、扩增和测序

总DNA提取采用(张得钧等, 2008)改进的CTBA，trnS-G序列扩增使用(Taberler et al., 1991)设计的引物trnS (5’-GCCGCTTTAGTCCACTCAGC-3’)和trnG (5’-GAACGAATCACACTTTTACCAC-3’)，引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应总体系为25 μL，内含2.5 μL 10×PCR Buffer、0.2 μL 2.5 mmol/L dNTP (含Mg2+)、正反引物各1.5 μL、0.2 μL (5 U) Taq DNA聚合酶、1.5 μL DNA模板和17.6 μL三蒸水。PCR扩增的反应程序为：94℃ 4 min，94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 90 s，35个cycles，末次循环在72℃ 7 min，4℃保存。扩增反应结束后，将PCR产物在含有溴化乙锭(EB)的1%的琼脂凝胶中电泳分离，以110 V的恒定电压电泳30 min，然后在紫外分析仪上观察扩增条带。PCR扩增产物送北京三博远志生物技术有限责任公司测序部进行双向测序，以保证测序结果的准确性。

3.3序列排序和分析

用Chromas软件查看测序结果，以下载的同源序列确定trnS-G序列的边界。用CLASTAL X软件进行序列比对，适当采用手工校正。利用MEGA软件计算(G+C)含量。运用DnaSP软件统计变异位点和单倍型。

3.4红景天苷含量测定

采用安捷伦1100 型高效液相色谱仪测定红景天苷含量，测定方法参考文献(王洋等, 2006)进行：(1)色谱条件：色谱柱Hypersil ODS ( 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-水(体积比1: 9)；流速1 mL/min；进样量为10 μL；检测波长280 nm。(2)标准液的配制：精密称取红景天苷对照品0.4 mg，于25%甲醇定容，作为红景天苷对照品储备溶液。(3)标准曲线的绘制：精密吸取红景天苷对照品储备液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL于10 mL容量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀。按照选定的色谱条件，以样品质量浓度(mg/mL)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线。分别分析不同浓度的标准溶液，测定均进行3次重复。(4)样品制备：精密称量2 g干燥的洮河红景天根粉末，于50 mL容量瓶中，加入45 mL一定体积分数的乙醇溶液，在不同的温度和时间条件下超声提取，冷却至室温，再用相应体积分数的乙醇溶液定容，摇匀。吸取1 mL上清液于离心管中，12 000 r/min离心5 min，备用。(5)色谱结果与红景天苷含量分析。

作者贡献

元王涛和刘明成全程参与试验过程、完成数据整理和分析；李梦婷和张育浩全程参与试验过程；张得钧负责采样、实验设计，指导和参与部分试验工作及撰写论文。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目《红景天苷形成和积累的分子机制研究》(81160519)资助。感谢中国科学院西北高原生物研究所高庆波博士和张发起博士为我们提供部分实验样品，感谢中国科学院西北高原生物研究所杨永昌先生为我们鉴定标本。

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