长期大强度运动可造成心肌损伤，一是物理性损伤，一是氧化损伤。在氧化损伤中，一方面，自由基攻击心肌细胞膜上的多不饱和脂肪酸产生脂质过氧化，使细胞膜功能与结构发生变化，例如细胞膜形变加剧，膜通透性改变，细胞内物质溢出，三磷酸腺苷(ATP)生成下将等。另一方面，抗氧化酶系统的平衡被打破，抗氧化酶活性降低引起蛋白质、核酸变性，引起细胞内线粒体等细胞器功能障碍及蛋白质合成困难(习雪峰等, 2012; 郭燕菊和彭峰林, 2012)，能量合成受阻，严重的影响心脏功能。黄酮是甘草重要的功能性成分，具有调剂机降血糖、抗氧化、抗肿瘤、、抗抑郁、抗菌消炎脂等功效(邹志梅等, 2012; 林晓春等, 2013; 陈东波和曾繁涛, 2014; 程瑞凤等, 2014;黄东等, 2014)。目前为止，甘草黄酮的研究较多运用于临床医学领域，运动医学领域的研究相对较少。本研究拟观察甘草黄酮对力竭运动小鼠心肌组织自由基代谢、一氧化碳系统、ATP酶活性的影响，以探讨甘草黄酮抗运动性心肌损伤的保护作用机制。

1结果与分析
1.1小鼠血清CK-MB、cTnI
与安静对照组相比(A组)相比运动训练组(B组)血清CK-MB、cTnI均极显著升高(p<0.01)；与运动训练组相比，运动低剂量给药组(C组)、运动中剂量给药组(D组)、运动高剂量给药组(E组)CK-MB、cTnI均显著或极显著降低(p<0.05, p<0.01)；与运动低剂量给药组(C组)相比，运动高剂量给药组(E组) CK-MB、cTnI显著升高(p<0.05) (表1)。

表1 小鼠血清CK-MB, cTnI的含量的比较

1.2小鼠心肌组织MDA含量、GSH-Px、SOD
与安静对照组(A组)相比，运动训练组(B组)MDA极显著升高(p<0.01)，GSH-Px、SOD、CAT极显著降低(p＜0.01)；与运动训练组(B组)相比，运动低剂量给药组(C组)、运动中剂量给药组(D组)、运动高剂量给药组(E组)MDA显著或者极显著降低(p＜0.01, p＜0.05)，GSH-Px、SOD极显著升高(p＜0.05)；与运动低剂量给药组(C组)相比，运动高剂量给药组(E组)MDA显著降低(p<0.05)，GSH-Px、SOD升高(p<0.05) (表2)。

表2 各组小鼠心肌组织MDA含量, GSH-Px, SOD活性的比较

1.3小鼠心肌组织NO含量、NOS活性
与安静对照组(A组)相比，运动训练组(B组)NO含量、NOS活性显著或极显著升高(p＜0.05, p＜0.01)；与运动训练组(B组)相比，运动低剂量给药组(C组)、运动中剂量给药组(D组)、运动高剂量给药组(E组) NO含量、NOS活性显著降低(p＜0.05) (表3)。

表3 各组小鼠心肌组织NO含量, NOS活性的比较

1.4小鼠心肌组织Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP活性
由表4可见，与安静对照组(A组)相比与安静对照组相比，运动训练组(B组)Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP活性均显著或极显著降低(p＜0.05, p＜0.01)；与运动训练组(B组)相比，运动低剂量给药组(C组)、运动中剂量给药组(D组)、运动高剂量给药组(E组) Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP活性均显著或极显著升高(p＜0.05, p＜0.01)；与运动低剂量给药组(C组)相比，运动高剂量给药组(E组) Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP活性显著升高(p＜0.05) (表4)。

表4 各组小鼠心肌组织ATP酶活性的比较

2讨论
血液中CK-MB是诊断心肌梗死的敏感指标，曾被认为是诊断心肌算上的“金标准”。它是有M和B亚基构成的杂化的二聚体，主要存在于心肌细胞的外浆层，是心肌酶谱的特异性酶。以往CK-MB是检测机体运动性心肌损伤的的重要指标，然而，在检测过程中CK-MB浓度的变化会受到受损骨骼肌中CK-MB的干扰，所以以血清中CK-MB浓度的变化判定是否心肌损伤，存在一定的质疑。心肌肌钙蛋白有心肌肌钙蛋白-T (cTnT)、心肌肌钙蛋白-I (cTnI)、心肌肌钙蛋白-C (cTnC)组成，近年的研究表明，心肌微小损伤后，在血液中均能测定到cTnI、cTnT的变化，尤其是cTnI更为敏感。因此，心肌肌钙蛋白逐步取代CK-MB，成为判定心肌损伤的重要指标。许思毛等(2011)的研究认为，大负荷运动过后，大鼠心肌cTnI在运动后即刻显著升高，在运动后24h已经有所恢复。本研究中，长期大强度运动引起血清中CK-MB、cTnI升高幅度较大，导致小鼠心肌细胞损伤，服用甘草黄酮后，小鼠CK-MB、cTnI显著降低，表明甘草黄酮对大强度运动引起的心肌损伤具有一定的保护作用，效果以高剂量甘草黄酮最佳。

大强度或过度训练会产生自由基，自由基攻击细胞膜系统的不饱和脂肪酸，引起生物膜的功能障碍，导致细胞膜通透性改变，细胞内外粒子转运发生紊乱，影响肌纤维的兴奋收缩偶联、线粒体功能紊乱、氧代谢能力减弱、ATP生成减少及能量供应不足等诸多生理反应，加重组织损伤(马兰军等, 2007; 熊静宇等, 2010; 熊正英, 2010)。MDA是脂质过氧化过程中的代谢产物，其含量多少间接反应体内被自由基攻击的程度。SOD、GSH-Px是常见的抗氧化酶，其重要功能是清除自由基。本研究中，运动组小鼠MDA升高，SOD、GSH-Px降低，表明大强度运动导致心肌组织脂质过氧化程度加深，自由基生成过多，服用甘草黄酮可以抑制这些现象，提高心肌组织中抗氧化酶活性，减少自由基的生成，效果以高剂量甘草黄酮最佳。原因可能有两个：一是甘草黄酮促进抗氧化酶活性；二是甘草黄酮或可以直接清除自由基。阳毅等(2013)的研究中，甘草黄酮可以提高力竭运动后肝组织中抗氧化酶的活性，抑制MDA的生成，抑制肝细胞凋亡，具有保护运动后肝脏损伤的作用。

在急性心肌缺血损伤中，NO与NOS具有双重作用：一方面，eNOS生成的NO有助于心血流畅通，降低血管阻力；另一方面，iNOS生成NO的毒性代谢产物引起更重的心肌损伤。本实验中，运动训练组NO含量、NOS活性明显升高，表明大强度运动诱发NOS活性增加，导致NO含量上升。运动给药组NO含量、NOS活性显著低于运动训练组，表明甘草黄酮通过抑制NOS的活性，减少NO的生成。

Na+/K+-ATPase与Ca2+/Mg2+-ATPase是两种ATP酶。Na+/K+-ATPase分布在细胞膜上，是重要的离子载体，同时也可以催化ATP水解，其中ATPase又是Na+、K+的载体。 Ca2+/Mg2+-ATPase主要调节心肌细胞中Ca2+的平衡，维持细胞浆内的低钙水平。两种酶的活性对于维持细胞膜内外Na+、K+、Ca2+、Mg2的正常分布，神经递质的代谢、释放，突触传递，神经元的兴奋传导，细胞的分泌、增殖等方面有重要的作用，常被用来评价神经元质膜功能(黄海定等, 2011)。

大强度运动导致心肌组织中自由基增多，自由基攻击ATPase，使其活性降低，影响其神经动能的兴奋与传导。本研究中，运动训练组小鼠心肌组织中Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP活性显著或极显著低于安静对照组，原因可能与运动导致小鼠ATP大量消耗与力竭运动产生大量自由基有关，大量自由基攻击ATPase，导致其活性下降。运动给药组小鼠心肌组织中Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP活性显著或极显著高于运动训练组，结果表明甘草黄酮能明显抑制大强度运动小鼠心肌组织中Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP活性的降低，维持细胞膜内外Na+、K+、Ca2+、Mg2的分布平衡，其中以高剂量组效果最佳。原因可能有两个：一方面甘草黄酮可以清除心肌组织中过量的自由基，提高抗氧化酶的活性，维持细胞膜上Na+、K+、Ca2+、Mg2的正常分布，与神经功能的兴奋传导；另一方面甘草黄酮可能参与了机体能量的供应，维持了运动中ATP的供给。

以上表明，长期大强度运动导致机体心肌损伤，甘草黄酮可提高机体心肌组织中抗氧酶、ATPase酶的活性，抑制自由基生成、NOS活性，减少NO的生成，维持细胞膜内外Na+、K+、Ca2+、Mg2的分布平衡。提示甘草黄酮对大强度运动造成的心肌损伤具有保护作用，效果以高剂量黄酮最佳。

3材料与方法
3.1实验动物及分组
6周龄昆明种小鼠(广西医科大学动物实验中心)，50只,雄性，体重18g~20 g。小鼠分笼饲养(每笼5只)，自由进食和进水，动物饲养室温26~28℃，湿度47%~65%，照明随自然昼夜规律。小鼠适应性饲养1周后，分安静对照组(A组, 10只)、运动训练组(B组, 10只)、运动低剂量给药组(C组, 10只)、运动中剂量给药组(D组, 10只)运动高剂量给药组(E组, 10只)。实验后期，除A组外，各组小鼠均有死亡，其中B组2只，C组1只，D组1只，E组1只，死亡原因为小鼠发生力竭时未及时捞起。

3.2试剂与仪器
甘草黄酮(武汉顶辉化工有限公司, 纯度＞50%)，测定心肌肌钙蛋白-I (cTnI)购自美国LDI公司，测定肌酸激酶同工酶MB (CK-MB)购自北京中生北控生物科技股份公司，测定谷超氧化物歧化酶(SOD)、胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、Ca2+/Mg2+-ATP、Na+/K+-ATP均购自南京建成生物工程研究研究所。小鼠游泳池(自制)，MP200A型电子天平、721型分光光度计为上海第二分析仪器厂生产，DL-46RC低速冷冻离心机、FSH-2高速电动匀浆机购为中科生物医学高科技开发公司生产。

3.3动物给药方法
C组、D组、E组小鼠灌胃时间每日9:00~10:00，剂量分别为5 g/kg/d、10 g/kg/d、15 g/kg/d黄酮溶液(生理盐水配制成5 mL/d溶液)。其他两组小鼠给予同体积的生理盐水，共20 d。

3.4训练方案
A组：不运动，安静饲养。
B组、C组、D组、E组：训练方案依据参考文献(史亚丽等, 2010, 中国运动医学杂志, (2): 211-213)，各组小鼠灌药0.5 h后，进行负重5%的游泳训练，共6周，一周6次。第一周为适应练习，训练时间为20 min/d，第二周起，每天增加5 min/d，直至训练时间为45 min/d。小鼠训练时间达不到而发生力竭时，迅速捞起，吹干身体后休息8 min，继续训练。训练结束后立刻吹干身体。

3.5取材及样品的制备
血清的制备：末次力竭运动结束后，小鼠眼眶取血，肝素抗凝，将抗凝血以3 000 r/min离心10 min，收集上清液，4℃冰箱待测。

心肌组织匀浆液的制备：称取适量小鼠心肌组织(0.3~1.0 g)放置烧杯中，按1:9的比例加入生理盐水后，用眼科小剪剪碎组织块(冰浴条件下)，6 000 r/min的转速冷冻机离心10~15 min，制成10%的匀浆液。ATPase和NO组织匀浆液采用1 000 r/min离心10~15 min，-80℃冰箱保存待测。

3.6测定方法
血清cTnI浓度采用ELISA法，CK-MB采用免疫抑制法，心脏组织总蛋白、SOD、MDA、GSH-Px、NO、NO、ATP酶的测定严格按试剂盒说明书进行。

3.7统计分析
采用SPSS 13.0统计软件包处理，所得结果用平均数±标准差( ±s)表示。安静对照组与运动训练组采用t检验比较差异，运动训练组、运动低剂量给药组、运动中剂量给药组、运动高剂量给药组采用单因素方差比较差异，非常显著性水平为p<0.01，显著性水平为p<0.05。

作者贡献
李敏华负责实验部分及论文构建与撰写；唐健负责实验部分；王春亮负责论文的审核与修订。

致谢
本研究由广西教育厅科学研究项目(201106LX531)资助。

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