美花石斛(Dendrobium loddigesiisii Rolfe)，是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)集药用价值和观赏为一体的珍贵兰花之一，属多年生附生草本药用植物，附生于岩石或树皮上，广泛分布于我国广西、贵州、云南等热带或亚热带地区(中国科学院中国植物志编辑委员会, 1999)；美花石斛也是《中国药典(2015版)》收载的石斛类药材的来源植物之一，具有滋阴、生津、润肺等的功效，可用于骨蒸劳热、目暗不明等多种病症的治疗(国家药典委员会, 2015)。在自然环境中，石斛种子由于缺少胚乳，难以自然萌发，因而野生种苗很少(李志英和徐立, 2014)；再加上其栖息地环境恶化和药农“掠夺式”采挖，导致其野生资源逐年减少。由于人类对石斛类药材的过度利用，很多石斛类植物，特别一些常用的石斛中药材，目前大多已濒临灭绝。所有兰科植物的野生种都已被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》(Convention on international trade in endangered species, CITES)；我国也将石斛属植物列入《中国植物红皮书-稀有濒危植物》(傅立国, 1991)。

近年来，我国学者在美花石斛的组织培养、种子萌发及内生真菌、化学成分等方面的研究(黄月纯等, 2014; 童文君等, 2014; 朱华等, 2011; 耿秀英和李泽生, 2012, 中国热带农业, (4): 36)，取得了一定的研究进展。但是，在美花石斛种子苗壮苗培养的研究还较少；目前美花石斛组培苗已通过组织方法进行扩繁，然而，组培苗却存在着苗势较弱、移栽成活率低等瓶颈问题，严重影响了美花石斛工厂化生产的进程。因此，本研究考察了不同基本培养基、植物生长激素、天然添加物和蔗糖浓度及活性炭对其壮苗构建的影响，旨在为美花石斛种质资源的保护与生产提供参考。

1结果与分析

1.1 不同培养基对种子萌发苗生长的影响

以0.5 mg/L NAA和30%椰汁为添加成分，观察MS等4种不同培养基对美花石斛种子萌发苗生长的影响。在接种培养3个月后，不同培养基对种子苗的增殖系数存在差异；美花石斛种子萌发苗在4种培养基上均能够增殖，但以1/2 MS培养基上的苗增殖系数最高，达到5.20，根条数也较多，苗高且深绿色；其次，B5和MS也能够较好地促进美花石斛种子萌发苗增殖、生根和增高；相比之下，MS-R培养基对美花石斛种子萌发苗的作用欠佳(表1)。综合苗的整体生长状况和生产成本等因素的考虑，优选1/2 MS为美花石斛种子萌发苗壮苗的基本培养基。

表 1 不同培养基对美花石斛种子萌发苗生长的影响

1.2不同植物生长素对种子萌发苗生长的影响

与不加植物生长素的空白对照相比，IBA、NAA和IAA等植物生长素均可以促进美花石斛种子萌发苗生根(表2)；其中，美花石斛种子萌发苗在添加了0.5 mg/L NAA的培养基上长势最佳，具体表现在株高、茎增粗，且生根较多。其次是IBA和IAA。此外，IBA和IAA在高温下容易失去活性，而NAA具有耐高温的特性。因此，优先选择NAA作为促进美花石斛种子萌发苗生根的植物生长素。

表 2 不同植物生长素对种子萌发苗生长的影响

1.3不同天然添加物对种子萌发苗生长的影响

美花石斛种子萌发苗在含有椰汁提取物的培养基上，长势优于香蕉提取物和土豆提取物(表3)。不同浓度的椰汁培养基，其壮苗效果存在差异；随着提取物浓度的增加，美花石斛种子萌发苗壮苗效果更好，在30%椰汁提取物的培养基上，苗茎粗壮，叶深绿，根粗长、发达；其次是香蕉培养基，种子萌发苗生长整齐，茎稍粗，叶绿、细长，根粗长、发达；而在含有土豆提取物的培养基上，种子萌发苗生长不整齐，茎较细，叶浅绿，根也相对较少。因此，优先选择椰汁作为美花石斛种子萌发苗壮苗培养的添加物，其次是香蕉和土豆提取物。

表 3 不同天然添加物对种子萌发苗生长的影响

1.4不同浓度蔗糖对种子萌发苗生长的影响

实验结果表明，蔗糖浓度过高或过低，均不利于美花石斛种子萌发苗的生长；蔗糖浓度为30 g/L时，美花石斛种子萌发苗长势均匀，茎节间伸长，茎粗，叶绿色，根绿色。而当浓度为60 g/L时，幼苗生长受明显的抑制，部分叶片呈现枯黄，苗长势不一致，弱苗较多(表4)。综合各浓度处理的苗长势，美花石斛种子萌发苗生长最为适宜的蔗糖浓度为30 g/L。

表 4 不同浓度蔗糖对种子萌发苗生长的影响

1.5添加不同浓度的活性炭对种子萌发苗生长的影响

根的数量及质量是组培苗壮苗和移栽成功与否的关键。实验结果表明(表5)，活性炭有助于美花石斛种子萌发苗的生根，且随着活性炭浓度的提高，根的数量也相应增加；当活性炭浓度为1 g/L时，美花石斛种子萌发苗茎较粗，生根数达到4~5条，平均根长达到3.5 cm以上；当浓度为6 g/L时，美花石斛种子萌发苗生根数虽然增加了，苗的长势反而差，表现在苗生长慢，根短，平均长度为2.0 cm左右。不加活性炭的空白对照，美花石斛种子萌发苗根少，且短。因此，适宜的活性炭浓度为1 g/L。

表 5 不同活性炭浓度对幼苗生长的影响

2讨论

结果表明，无菌萌发100天左右的美花石斛幼苗最佳的壮苗培养基为：1/2 MS +0.5 mg/L NAA+30%椰汁+30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+琼脂7 g/L，pH为5.8。在此培养基上，美花石斛种子萌发苗生长均匀，苗的茎粗、叶绿、根多，并能够大大缩短组织培养的周期，在短时间内获得大量标准的美花石斛壮苗，为大规模人工栽培生产提供高质量的种苗。

本研究通过对美花石斛种子萌发苗的壮苗技术进行了系统性实验，探索出一条人工快速壮苗培养的途径，为美花石斛及石斛属植物种苗的生产提供了理论依据和技术基础。通过壮苗的培育，可大大地提高石斛苗的移栽成活率，提高石斛的产量和质量，从而实现野生资源的可持续利用和保护。

3材料与方法

3.1研究材料

美花石斛蒴果，来源于广西桂林市永福县的野生植株。

3.2美花石斛蒴果的消毒和种子的萌发

首先，在自来水下冲洗干净美花石斛蒴果表面；在超净工作台上，先将蒴果浸泡在75%的酒精溶液中30 s，再转到3%次氯酸钠溶液中消毒10 min，然后无菌水冲洗3次。再用无菌手术刀切开蒴果，采用无菌毛笔沾上种子，均匀地播种在N6培养基上。接种后的材料，转到培养室中培养，培养条件为：24±2℃，光照强度1 000~1 500 lux，光照时间10 h。

经过100天左右的培养，美花石斛种子即可以萌发形成本研究所需要的无菌幼苗，幼苗长出根2~3条，叶片2~3片。

3.3不同培养基对种子萌发苗生长的影响

考察MS、1/2 MS、B5、MS-R等4种不同基本培养基对幼苗生长的影响。其它成分一样，其中，NAA的浓度为0.5 mg/L；蔗糖和椰汁的添加量分别为3%和30%，pH值为5.8。

3.4不同植物生长素对种子萌发苗生长的影响

选择NAA、IAA、IBA等3种植物生长素，考察不同植物生长素及浓度对美花石斛种子萌发苗生长的影响；每个处理分别设计3个浓度梯度：0.5 mg/L、1.5 mg/L、3.0 mg/L；以不加任何植物生长素的处理为空白对照。以1/2 MS为基本培养基，附加3%蔗糖和30%椰汁，pH值为5.8。

3.5不同天然添加物对种子萌发苗生长的影响

选择土豆提取物、椰汁(椰子中的液体成分)和香蕉等3种天然添加物，考察不同天然添加物及浓度对美花石斛种子萌发苗生长的影响；每个处理分别设计3个浓度梯度：10%、20%、30%；以不加添加物为空白对照。以1/2 MS为基本培养基，附加3%蔗糖，pH值为5.8。

3.6不同浓度蔗糖对种子萌发苗生长的影响

以组织培养中常用的糖源――蔗糖为对象，考察15 g/L、20 g/L、30 g/L、60 g/L等4个不同浓度的蔗糖对幼苗生长的影响。以1/2 MS为基本培养基，添加30%椰汁，pH值为5.8。

3.7活性炭对种子萌发苗生长的影响

考察不同浓度活性炭对种子萌发苗生长的影响。浓度梯度为：0 g/L、0.5 g/L、1 g/L、3 g/L。以1/2 MS为基本培养基，附加3%蔗糖和30%椰汁，pH值为5.8。

3.8培养条件

本研究的所有培养基均添加琼脂7 g/L。培养条件为：24±2℃，每天光照10 h，光照强度1 000~1 500 lux；培养周期为90天。

3.9数据统计

种子萌发苗接种培养90 d后，分别观察并统计株高、增殖系数、根数等。

作者贡献

韦艳梅、周雅琴是本研究的实验设计和实验研究的执行人；韦艳梅、周雅琴及谭小明完成数据分析，论文初稿的写作；谭小明参与实验设计，试验结果分析；谭小明是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析；韦艳梅负责论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由广西科学基金(2015GXNSFDA139012)资助。

参考文献

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