泛素26S蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)是目前已知的有选择性的降解蛋白质的最重要途径之一(郭启芳等, 2004)，该途径通过调节功能蛋白质的周转或降解不正常蛋白质，实现对多重代谢过程的调节(朱经春等, 1999)，在维持细胞功能以及抵御环境胁迫、细胞周期运转、激素响应、胚胎发育和衰老等方面起重要作用(董发才和宋纯鹏, 1999; 盛仙永等, 2004; Ingvardsen and Veierskov, 2001;  Moon et al., 2004; Smalle and Vierstra, 2004; Dreher and Callis, 2007; Zhang et al., 2007; Shi et al., 2009; 王金利等, 2010; 徐晨曦等, 2007)。

泛素化过程是一个受到高度调控的复杂过程，有3种类型的酶参与催化3个级联反应，这3类酶是泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme, E1)、泛素结合酶，也称泛素缀合酶(ubiquitin-conjugating enzymes, E2) 和泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligating enzymes, E3) (黄海杰和陈雄庭, 2008)。

植物中泛素化研究最深入透彻的是模式植物拟南芥，约有1 400个基因(约占总蛋白质数量的5%)编码泛素化过程的3大类酶。其中，编码E1的基因有2个，发生突变时拟南芥死亡；E2基因37个，E2-like 基因8个；E3基因则有1 300个，泛素化底物的特异性由E3决定(Smalle and Vierstra, 2004)。

近年来，E3蛋白的作用研究开展较多并取得了较大进展(许传俊和李玲, 2007; Göhre et al., 2008; Lai et al., 2009; Lee et al., 2009; Pan et al., 2009)，而E2蛋白功能研究尽管也取得了一定进展，但相对缓慢(王金利等, 2010)。

油茶(Camellia oleifera)与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料树种，是我国的本土树种，现有面积达3.3×10⁶ hm²，是我国亚热带地区山区林农的重要经济来源之一，在江西、湖南、浙江、广西、福建等省的经济林产业中占有十分重要的地位(庄瑞林, 2008)。近年来，在国家政策扶持下，各省均有相关政策和资金支持，油茶产业发展迅速，与之相呼应，油茶良种选育、丰产栽培技术等研究进展较快，新品种高产林面积不断扩大，经济效益显著。但与农作物、杨树、杉木等其它研究开展较早的林木相比，油茶分子基础研究甚少。郭静怡等已克隆了一个油茶泛素连接酶E2基因(编码152个氨基酸残基，本论文中命名为UBE2A，并对其进行了cDNA序列分析和RNAi表达载体构建(郭静怡, 2011)，但对其编码的蛋白质的性质特点等未作研究。

本研究采用solexa技术对普通油茶“长林4号”无性系发育中的种子转录组测序，获得了1条编码泛素结合酶(E2)的全长cDNA序列，命名为UBE2S，通过对该基因的序列分析和编码蛋白质的结构预测分析，对普通油茶发育中种子的蛋白泛素化过程初探端倪，以期为进一步的深入研究奠定基础。

1结果分析
1.1泛素结合酶(UBE2S)的全长cDNA序列分析
通过序列比对和分析，UBE2S基因cDNA全长1 155 bp，编码区自183位的起始密码子ATG起，终止于995位的TGA，5’UTR 182 bp，3’UTR 160 bp，编码270个氨基酸，推测蛋白质分子量是29.36 KD。编码的270个氨基酸中有33个强碱性AA (K, R)，30个强酸性AA (D, E)，88个疏水性AA (A, I, L, F, W, V)和72个极性AA (N, C, Q, S, T, Y)。其AA序列为：MATNENLPPNVIKQLAKELKNLDETPPEGIKVGVNDDDFSIIYADIEGPAGTPYENGVFRMKLILSHDFPHSPPKGYFLTKIFHPNIATNGEICVNTLKKDWNPSLGLRHVLIVVRCLLIEPFPESALNEQAGKMLLENYEEYARHARLYTGIHALKQKPKFKSGAISESTTALNVDQSNTSVLNVDEKKASSGAALPLPSPLASTTTFTKGGNGQDQPASALNSTTETGVSSDSVAAPPPVTQKKEVTLAKVQADKKKMDARKKSLKRL

1.2UBE2S基因同源性比对分析
通过Blast比对，筛选出序列同源性较高的2个物种的UBE2S序列，分别为大豆和葡萄，油茶UBE2S基因的cDNA序列与上述2个物种的同源性分别为64.19%和68.63%。采用clustalX软件对上述3个物种E2的氨基酸序列进行多序列比对分析显示(图1)，3个物种的UBE2S氨基酸序列同源性达84.69%，油茶的UBE2S和其余2个物种的UBE2S的氨基酸序列同源性分别为78.76%和81.47%之间，说明UBE2S的氨基酸序列在植物中具有较高的保守性。
 

1.3编码蛋白的保守区域分析
ScanProsite 和CDD对油茶UBE2S保守结构域的分析结果显示，UBE2S第13~145位氨基酸碱基为其泛素结合酶基因家族的保守区域，第79~127位氨基酸残基区域中有21个残基与泛素形成硫酯键中间产物的残基(图3C)，其中94位的半胱氨酸残基是活性位点(图2)。该活性位点旁边有如下保守序列[FYWLSP]-H-[PC]-[NHL]-[LIV]-x(3,4)-G-x-[LIVP]-C-[LIV]-x(1,2)-[LIVR]。第13的K、70的P、71的H、101位的P、102位的S共5个残基是与E3酶相互作用的位点(图3D)。
 

1.4 三维结构分析
UBE2S三维结构显示，该基因仅包含一个保守功能结构域，该结构域由4个α螺旋和4个β折叠片构成，α1、α2和α3分别位于保守结构域的两侧，位于α4与β折叠片之间的长环上的半胱氨酸活性位点，处于蛋白质表层的浅窝中(图4粉色圆球所表示位置)。此外，与泛素通过硫酯键结合的残基位点及与E3相互作用的残基位点也位于蛋白质浅表凹陷处周围(图5和图6)
 

2讨论
泛素26S蛋白酶体途径能够选择性的降解蛋白质，这在许多代谢过程中起关键作用，是真核生物重要的翻译后修饰系统，如参与调控细胞周期、应急反应、信号传导及DNA修复等(陈建明和余应年, 2000)。蛋白质发生单泛素化不会水解，但可调节其生物学活性，如调节蛋白质稳定性、蛋白三级结构、改变染色体结构、基因修复、复制及表达调节等。

靶蛋白的多泛素化需要进行多轮单泛素化反应，每轮单泛素化过程均是一系列的酶促级联反应，E2在单泛素化过程中催化第二步反应。目前研究表明，所有真核生物都有多种E2，例如，已发现人类的E2至少有30种，拟南芥有37种，不同的E2在对靶蛋白的特异性选择上具有重要作用。推测正是由于每个物种中均有一个庞大的E2基因家族，大多数物种中已克隆的E2基因数量较少，因此油茶UBE2S基因在genebank中只比对到2个同源性较高的序列。E2根据其结构和功能大致可以分为4类(陈建明和余应年, 2000; Plafker et al., 2004; Matuschewski et al., 1966; Jentsch; 1992)：Ⅰ类E2，只有一个保守催化结构域(UBC)，长约150 AA，其功能主要是参与短周期蛋白和异常蛋白的泛素依赖性降解；Ⅱ类E2，由UBC和一个C-末端延伸结构组成，其C-末端结构可参与识别目标蛋白、与E3酶相互作用等；Ⅲ类E2，由UBC和一个N-末端延伸结构组成，目前尚不清楚N-末端结构的功能；IV类E2，同时具备UBC、C-末端结构和N-末端结构。油茶UBE2S含有E2的保守催化结构域、活性位点半胱氨酸残基，第146位~270位AA为C-末端延伸结构，因此油茶UBE2S属于油茶Ⅱ类E2。

植物体内的E2种类繁多，不同种类具有不同的功能，在受到胁迫时，不同种类的E2通过表达量的变化等表现出不同的表达方式(赖燕等, 2008)。研究表明，拟南芥的很多E2基因有多个拷贝，产生E2蛋白冗余，推测这可能造成了E2基因研究进展相对缓慢的现状。随着solexa等高通量测序技术的出现和发展，大量植物的全基因组或转录组测序完成，利用不同植物研究E2基因的功能，有希望可大大推动E2基因的研究进展。本研究只对油茶UBE2S做了简单的序列分析和保守结构域分析，对油茶其它E2成员的克隆、功能鉴定等相关研究有待于进一步开展，这将为油茶抗逆研究打下良好的基础。

3材料与方法
3.1研究材料
分别于油茶种子开始膨大期、营养高速合成期、近成熟期选取4个时间点采集“长林4号”种子，剥取种仁，液氮中保存备用。本研究所用研究材料采自浙江省金华市东方红林场。

3.2RNA样品制备
样本RNA提取采用Trizol法，提取的RNA采用Nanodrop、Agilent Bioanalyzer 2100及琼脂糖凝胶电泳检测质量。将符合要求的RNA样品进行转录组测序分析。转录组测序及序列组装、拼接由深圳华大基因公司完成。

3.3生物信息学分析
通过与Nr数据库进行BlastP(Altschul et al., 1997)比对，筛选出油茶UBE2S基因cDNA序列。利用DNAstar软件分析推导ORF 及编码蛋白(UBE2S) 的氨基酸序列，使用C lustalX软件进行多序列比对, 使用http://www.us.expasy.org网址的ScanProsite (De et al., 2006)和CDD (Marchler-bauer et al., 2005; 易乐飞等, 2009)分析保守功能结构域, 使用Swiss-model (Schwede et al., 2003)预测三维结构。

作者贡献
林萍、曹永庆、滕建华是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成数据分析，论文初稿的写作、实验设计、试验结果分析；姚小华、王开良是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
基金项目：本研究由林业公益性行业科研专项(201004008)和中国林科院亚林所公益性科研基金专项(RISF6804)共同资助。

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