菠菜(Spinacia oleracea L.)别名波斯菜、赤根菜，系藜科(Chenopodiaceae)菠菜属(Spinacia)，是具有2n=12条染色体的二倍体雌雄异株植物，是重要的蔬菜作物。由于不同性别的菠菜经济价值不同，因此，寻找菠菜雌、雄基因组之间的差异，克隆菠菜性别决定的基因对于菠菜性别的早期鉴定及分子育种尤显重要。近年来，有些学者通过核型分析(Lan et al., 2006)、同工酶技术(高武军等, 2006)、RAPD分子标记(杨金华等, 2009, 江苏农业科学, 2: 40-41)等方法对菠菜的性别分化进行研究。相对于其它分子标记，EST (expressed sequence tags,  EST)-SSR标记由于具有非常独特的优点而被广泛应用。目前，基于EST数据的SSR标记已在一些植物种中成功开发和应用，如大豆(常玮等, 2009)、棉花(王亚男等, 2010)、花生(柳展基等, 2008)、水稻(忻雅等, 2006)、甘蔗(黄立飞等, 2009)、油菜(李小白等, 2007)、橡胶树(安泽伟等, 2009)。但国内外对于菠菜性别相关的EST-SSR标记的研究还未见报道。基于此，本研究对现有NCBI上菠菜EST中的SSR信息进行全面分析，以明确菠菜EST-SSR发生频率和特点，并根据EST-SSR序列设计特定引物对对菠菜雌、雄基因池进行扩增，探讨EST-SSR序列在菠菜性别分化研究中的应用。

1结果和分析
1.1菠菜EST-SSR分布、频率与特点
对来自NCBI数据库1 093条菠菜EST进行SSR搜索，含SSR的EST共64条，占EST总数的5.86%。1 093条EST序列全长为633.516 kb，共含有68个SSR，其中二核苷酸重复基元占主导地位，出现22次，占总SSR的32.3%。其次为三核苷酸和五核苷酸重复基元，两者发生频率基本相近，分别出现17次和18次，占总SSR的25.0%和26.5%。四核苷酸重复基元和六核苷酸重复基元分别占1.5%和14.7% (表1)。

表1 菠菜EST中SSR的出现频率 Table 1 Frequency of SSRs occurred in ESTs of spinach

在所有的SSR中，共包括22种重复基元(不包括类似于转座子或逆转子中可见到的复杂重复)。其中以二核苷酸GA/CT和五核苷酸ACCAA占绝对优势，分别占总SSR的22.06%和17.65%。其它类型的重复基元频率都很低(表2)。

从重复基元的重复特性来看，菠菜的EST-SSR重复基元可分为完全重复基元和不完全重复基元，分别为48个和20个，所占百分比为70.59%和29.41%，完全重复占绝对优势(表3)。菠菜EST中SSR的平均长度约23.49 bp，不同的SSR长度有很大差异，最短的为15 bp，最长的为36 bp

表3 菠菜EST中SSR重复长度和性质 Table 3 The repeat length and attribute of SSRs in ESTs of Spinach

1.2 EST-SSR引物的筛选及应用
利用根据以上筛选出的菠菜EST-SSR设计的引物对，对菠菜雌、雄基因组进行了PCR扩增验证。结果表明，基于菠菜EST序列HS097148设计的引物对EST-SSRP03在菠菜雌、雄株基因组中出现多态性。在雄性基因组中扩增出一条分子量大约200 bp的条带(图1)。

图1 EST-SSRP03引物对雌、雄基因组的PCR扩增结果 Figure 1 PCR amplification pattern of male and female genome using EST-SSRP03 primer pair

2讨论
2.1菠菜EST-SSRs的分布特点
植物EST-SSR序列总的检出率和不同重复基元的频率不仅取决于序列的冗余程度，也与搜索软件、搜索标准和收集数据有关(Yan et al., 2008)。一般情况下，当最小重复长度设置为20 bp时，大多植物种类EST中SSR的检出率大约为5% (Varshney  et al., 2005)。本研究从1 093条菠菜EST序列中，检出68个SSR标记，检出率6.22%，略高于大多数植物报道的检出率。

一般来说，EST-SSR标记在同一种属物种内具有良好通用性(Poncet et al., 2006)。但不同种属物种中重复类型出现的频率和所占比例有一定差异(常玮等, 2009)。根据以往报道，三核苷酸(trinucleotide repeat, TNRs)和二核苷酸重复类型(dinucleotide repeat, DNRs)的EST-SSR最为常见。如Varshney 等(2002)等报道在禾谷类作物中TNRs所占比例最高(54%~78%)，其次为DNRs (17.1%~40.4%)和TTNRs (3%~6%)。另外在小麦(Gupta et al., 2003)、葡萄(Scott et al., 2000)、柑橘(江东等, 2006)、苜蓿(Eujayl et al., 2004)、棉花(王长彪等, 2006, 科学通报, 51(3): 316-320)中，都以三核苷酸重复为主。而本研究中统计得到的菠菜重复基元类型分布以DNRs最多，占总数的32.3%。在二核苷酸重复中，出现频率最多的重复基元是GA/CT，这与在水稻、玉米、大豆、高粱中得到的结果是一致的(Li et al., 2008)。

2.2建立菠菜EST-SSR标记的潜力与局限性
与其它分子标记相比，EST-SSR标记具有很多独特的优点。EST-SSR分子标记不仅可以用于遗传多样性、物种起源进化及比较基因组学等研究，由于EST-SSR直接来源于表达基因编码区序列，因而如对不同表现型的同类物种间差异EST-SSR进行比对筛选，在获得的特异性EST-SSR背后就代表着某特异性表达基因，可进行功能基因的发现与定位相关研究。本研究中，利用EST-SSR引物序列从雄性基因组中扩增出一条分子量为200 bp左右的特异性条带，因此推测该片段可能与菠菜性别分化相关，这为菠菜性别分化基因的克隆及早期性别鉴定奠定了基础。

目前，对菠菜进行EST-SSR开发与应用还存在很多局限性。NCBI database数据库中收录的菠菜EST序列数目很少，仅有1 093条。而一些主要的粮食或经济作物已收录的EST序列，已达几十万甚至几百万条。在这些物种中进行EST-SSR标记的开发结果也更丰富，更具有代表性。相信随着菠菜中新的EST序列被发现，利用EST进行研究的前景将更广阔。总之，本研究根据NCBI数据库中现有的菠菜EST资源，在明确了菠菜EST中的SSR信息后建立了EST-SSR标记并应用到菠菜性别分化的研究中。结果表明，基于菠菜EST数据开发菠菜性别相关的EST-SSR标记的方法是切实可行的。

3材料与方法
3.1植物材料和DNA提取
菠菜植株取自河南师范大学生物科学学院实验田。分别选取已知性别的雌、雄菠菜植株新鲜幼叶，然后将其洗净、晾干，液氮中研磨，采用改良的2×CTAB法提取DNA。

3.2 EST序列获得和预处理
从NCBI (美国国立生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找菠菜EST，共计1 093条(截止2011年5月)。对该1 093条EST序列，利用在线软件EST-trimmer (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/) 除去其中的ploy A/T尾和载体等序列。并利用在线软件Repeat Masker (http://www.repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker)搜索重复序列。

3.3菠菜EST中SSR信息分析
利用在线软件SSRIT (http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)搜索SSR。检索标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复序列重复次数分别大于或等于8、5、4、3、3。

3.4 EST-SSR引物设计与合成
利用引物设计软件Primer 3.0设计了7对菠菜EST-SSR引物(表4)。设计引物时主要有以下要求：EST序列长度大于100 bp；SSR序列的开始和结束位置分别距5’和3’端不少于20 bp；引物长度18~24 bp；退火温度Tm值介于40.4~65.4℃，且上下游引物复性温度相差不大于5℃；GC含量为40%~60%；预期扩增产物100~500 bp；尽量避免引物二聚体、错配和发夹及颈环结构等(安泽伟等, 2009)。

表4 7 对菠菜EST-SSR序列引物 Table 4 7 EST-SSR primers designed from spinach EST sequences

3.5 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳
设置25µL的PCR反应体系：1×Taq DNA聚合酶缓冲液、2.5 mmol/L MgCl₂、0.5 U DNA Polymerase、200 µmol/L dNTP、上下游引物各0.25 µmol、模板DNA 100 ng。所用试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。温度循环条件：95℃预变性5 min；循环步骤为94℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃ 2 min共45个循环；最后72℃延伸10 min。

琼脂糖凝胶电泳：扩增后的产物与6×loading buffer混合，经过3.0%的琼脂糖凝胶(TBE缓冲液, 含EB 0.5 µg/ml, 100 V电压)电泳分离，检测扩增产物的可用性和多态性。用Gel Doc EZ成像系统进行观察、拍照和分析。

作者贡献
第一兼通讯作者邓传良确立了本论文的总体思路，对研究过程中存在的问题进行指导并进行论文的修改；第二作者高俊和第三作者曹莹共同完成了本文研究中的实际工作，并进行了本论文的起草；其它作者秦瑞云、高武军和卢龙斗在实验过程中给予了很多帮助和指导，并对论文的修改提出了一些建议。

致谢
本论文得到国家自然科学基金项目(编号：31000165)，河南师范大学校青年骨干教师项目资助，在此表示感谢！

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