柑橘是世界第一大水果。目前对柑橘生产危害最为严重的病害有黄龙病、溃疡病、衰退病等(Gmitter et al., 2012)。采用药剂防治虽然也有一定的效果，但势必造成环境污染，而且易导致食品安全问题；持续用药，病原物可能会产生抗药性(Behlau et al., 2011)，从而会加大防治难度。喷施农药虽然有一定的功效，但长期喷施容易带来3R (Residue, Resistance, Resurgence)问题。因此抗病育种成为柑橘育种的重要目标之一。若成功分离和克隆R基因，直接在基因水平上开展基因工程育种，则能有效加快抗病育种进程。

植物抗病基因(Resistance gene, R基因)的克隆与分析已经成为植物抗病育种的研究热点。1992年玉米抗圆斑病基因Hml被克隆，这是世界上第一个被克隆的R基因(Johal and Briggs, 1992)。之后有学者发现R基因的序列同源性较高，编码的蛋白质具有相似的结构域(Ellis et al., 1995; Song et al., 1995; Lawrence et al., 1995;Grant et al., 1995; Zhou et al., 1995; Hammond-Kosack and Kanyuka, 2007)。Kanazin等(1996)利用R基因产物的保守结构域设计引物对植物DNA进行扩增，发现扩增产物与R基因同源性较高，将其称之为resistance gene analog (RGA)，中译为抗病基因同源序列。也有学者将称之为resistance gene homologue (RGH, Brotman et al., 2002)，resistance gene candidate (RGC, Shen et al., 1998)，resistance gene-like sequence (RGL, Vicente and King, 2001)，分别中译为抗病基因类似物、抗病候选基因、类抗病基因序列。其中抗病基因同源序列(RGA)被广泛使用。RGA是一类结构上与R基因类似的序列。有的RGA与R基因紧密连锁，有的RGA本身即是R基因。根据RGA的上述特点，RGA在以下几个方面得到了应用：作为一种分子标记，用于标记抗病基因(丁国华, 2004)，构建遗传图谱(Bakker et al., 2011; Niu et al., 2011)、分子标记辅助育种(Silva et al., 2012)以及种质资源分析(肖天霞, 2006)；将RGA作为探针，筛选基因组文库克隆抗病基因(Feuilet et al., 1997)。

目前克隆RGA有两种方法：PCR扩增得到RGA，数据库检索法预测RGA (张礼凤等, 2009; 任鄄胜, 2008; 尚世界, 2009; Rossi et al., 2003)。柑橘RGA研究亦有所开展。本文将对柑橘RGA的研究进展作一综述，并对柑橘RGA的应用进行了探讨。

1 PCR扩增得到柑橘RGA
目前,获得柑橘RGA，多采用PCR扩增的方法。PCR扩增的方法有两种类型：一种是根据R基因编码的蛋白质保守结构域设计简并引物，对基因组DNA进行扩增，得到RGA；另一种是根据R基因保守序列设计引物，对cDNA进行扩增，得到有表达信息的RGA。

对基因组DNA进行扩增获得RGA是比较常用的方法。Deng等(2000)根据NBS类抗病基因产物的保守结构域设计6条简并引物，构建4个引物组合，对柑桔属和枳属的属间杂种“USDA17-47”的基因组DNA进行扩增，扩增产物的序列分析表明，22条序列属于NBS-LRR类R基因超家族，并开发了与柑橘衰退病和根结线虫有关的CAPS标记。Deng等(2003)以“USDA17-47”为试材，根据水稻白叶枯病抗性基因Xa21和番茄青枯病抗性基因Pto编码的氨基酸保守结构域设计2条简并引物，最终克隆获得29条柑橘蛋白激酶类RGA，且明确了各序列以1～3个拷贝形式存在基因组中，利用引物步行法获得2个序列的全长，具备Xa21蛋白的全部特征。安然(2010)根据细菌斑点病基因prf和拟南芥霜霉病基因RPM1编码的蛋白质保守结构域NBS-LRR设计2条简并引物，对构橼、贞橙、三叶、椮橙、宜昌橙25-86、冰糖橙6个柑橘品种的基因组DNA进行扩增，获得了9个RGA。

对cDNA进行扩增获得RGA的研究较少。谌谋华(2003)根据已知抗病设计了8条引物，组成15对引物，对枳壳、九里香、黄皮、国庆1号的基因组DNA及枳壳、九里香、国庆1号的cDNA进行扩增，获得了25个RGA，并以其中的RGAn-17-2作探针，对柑橘基因组DNA进行RFLP分析，RGAn-17-2在枳壳、九里香、黄皮、国庆1号中都有若干同源片段。黄代青等(2004)提取琯溪蜜柚花柱的总RNA，通过逆转录合成其cDNA，根据R基因编码的蛋白质NBS 保守结构域设计2条简并引物，对cDNA 进行扩增，获得大小约为500 bp的PCR 产物，对连接产物进行酶切归类，筛选得到不同类别的克隆12个，并进行了测序。通过序列同源比较分析发现，其中有10个片段属于NBS-LRR 类RGA，与已知植物R 基因相应区段的氨基酸序列的同源性为11.5%～47.1%。

目前,几乎所有已知柑橘RGA都是通过PCR扩增的方法获得。这种方法对没有全基因序列且基因组庞大的物种来说比较适宜，但不足之处是不能覆盖全基因组的RGAs。急需采用新的方法满足柑橘RGA研究的需要。

2数据库检索法预测柑橘RGA
随着基因组学及生物信息学的发展，许多植物的EST序列相继公布，并且一些物种基因组测序已经完成，发展了数据库检索(data mining)的方法，即从EST或基因组测序中利用生物信息学手段寻找RGAs，可以获得该物种全基因组的表达RGA。该方法简单快速，信息量大，是预测R基因的有效方法，已成功地在大豆(张礼凤等, 2009)、甘蔗(Rossi et al., 2003)、小麦(Dilbirligi and Gill, 2003)、玉米(Xiao et al., 2006)、水稻(肖天霞, 2006; Wang et al., 2005)等作物上成功应用。目前在柑橘上尚未见利用数据库检索法获得RGA的报道。柑橘的基因组较小，基因组测序已经完成(www.phytozome.net; http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)。若用数据库检索的方法在全基因组水平上克隆柑橘RGAs，将提供一个通过RGA途径高效克隆柑橘R基因的技术平台，会大大加快柑橘抗病基因研究的进程。

3柑橘RGA的应用
Yang等(2001)根据NBS保守结构域设计了一对简并引物，对枳壳BAC文库进行扩增和酶切，获得了一个1.2 M的重叠群，其中包含了柑橘衰退病抗性基因座。这个基因座的几个预测抗性基因与水稻Xa21基因，番茄Cf-2基因以及拟南芥RPS2基因相似，可用于标记抗病基因。

向旭等(2005)对从柑桔与枳属间杂种的基因组DNA 所获得的RLK-RGA，设计简并引物，对柑桔抗溃疡病材料和感病材料进行分析，获得了一个与柑橘溃疡病相关的特异性更强的抗性标记－19h16/Dde1标记位点，可用于分子标记辅助育种。

Songwattana (2010)利用12对NBS-LRR RGA序列(Deng et al., 2000)作引物结合限制性酶切对泰国莱檬杂种m33以及父母本Pan and Nam Hom的抗性基因进行了筛选，结果表明标记Pt9/Alu1、Pt14/Bfa1、16R1-19/Tru1I 与M33和Nam Hom lime的抗性基因紧密连锁；Pt9和16R1-19的蛋白质分析表明其属于non-TIR-NBS-LRR亚家族，Pt14属于TIR-NBS-LRR亚家族。

向旭等(2009)利用3个与柑橘根结线虫连锁的NBS-LRR RGA序列(Deng et al., 2000)作标记，对柑属和枳属的属间杂种“USDA17-47”进行扩增并酶切，获得了一个柑橘根结线虫抗性标记。

Gulsen等(2010)利用2个RGA标记(Deng et al., 2000)结合SRAP、SSR、ISSR、POGP、RGA及 RAPD标记建立了一个柑橘连锁图谱。

上述柑橘RGA的应用多集中于抗性标记方面。利用柑橘RGA克隆抗病基因尚未见报道。

4 展望
基于RGA克隆抗病基因已经得到共识。但利用RGA进行抗病基因克隆也存在一些问题：抗病基因编码的蛋白质由于密码子的简并性，根据抗病基因产物的蛋白质保守结构域设计的简并引物特异性不足；同源序列同源性不一，也使得引物设计有偏差；抗病基因多成簇存在，克隆得到的RGA不一定是目的片段。已有学者对其进行改进，如用高分辨率的PAGE胶代替琼脂糖电泳，提高扩增产物的分辨效率(Rivkin et al., 1999)。也可直接将RGA转入柑橘植株，观察转基因植株的表现，进而分析RGA的功能，或者根据RGA序列设计特异性引物，转换为CAPS标记，可用于分子标记辅助育种。与水稻、小麦等作物相比，柑橘RGA的研究较为薄弱，对其利用也研究较少。柑橘基因组测序的完成为在全基因组水平上大规模挖掘RGA提供了新契机。在后基因组时代，柑橘RGA将会在柑橘抗病研究中发挥更大的作用。

作者贡献
张艳芳是本综述的主要执行人；温寿星、黄镜浩、包榕负责本综述的后期修改；蔡子坚是本综述的构思者。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由福建省农业科学院博士科研启动基金项目(2010BS-2)、福建省自然科学基金(2011J05052)资助。感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。

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