水稻为世界三分之一以上人口提供粮食和能量，是我国最重要的粮食作物，也是世界上最重要的粮食作物之一。随着人口的不断增加和耕地面积的不断缩减，以及人民生活水平的不断提高，对粮食的需求及对品质的要求将愈来愈高。要想提高水稻的产量在很大程度上依赖对水稻，特别是野生稻中丰富基因资源的开发和持续利用(卢宝荣, 1998)。

水稻所隶属的稻属包含22个种(朱其慧, 2005)，其中有2个栽培种，即亚洲栽培稻(O. sativa)和非洲栽培稻(O. glaberrima)。非洲栽培稻仅在非洲种植，亚洲栽培稻在世界各地广泛栽培。稻属的一年生野生稻(O. nivara)和多年生野生稻(O. rufipogon)，分布于亚洲热带和亚热带地区，与栽培稻具有相同的基因组型(AA基因组)，被认为是亚洲栽培稻(O. sativa L.)的祖先种(段世华等, 2009)。除AA基因组的野生稻外，稻属还包括其它基因组的野生稻，如CCDD基因组的大颖野生稻等。

亚洲栽培稻迄今已经有一万一千多年的栽培驯化历史(Normile, 1997)，在其栽培驯化过程中由于适应不同的农业生态环境和人工的共同选择形成了丰富的遗传多样性和明显的遗传分化，如：籼稻(Indica)-粳稻(Japonica)分化(Vaughan et al., 2008; Lu et al., 2002; 刘克德等, 1995)，水稻-旱稻分化(王一平等, 2007)和粘稻-糯稻分化(Olsen et al., 2006)。在栽培稻的遗传分化中，籼稻和粳稻的遗传分化最为重要，产生了适应不同生态环境种植的类型(Morishima and Oka, 1981)。因生境不同而带来的丰富的稻种资源又是栽培稻进一步改良的物质基础，而优异的稻种资源的利用是水稻育种取得突破性进展的关键之一。

淀粉是稻米的主要成分，占稻米干重的90%左右，是决定水稻籽粒产量和稻米品质的关键因素。淀粉生物合成和积累的过程发生在稻米淀粉体中，并在一系列酶的催化作用下形成。在水稻中参与这一反应的酶约有33种，其中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase, AGPase)起着重要作用。它的主要功能是把葡萄糖转变为合成淀粉的底物ADP葡萄糖(Amir and Cherry, 1972)，它是植物代谢活动向淀粉合成方向发展涉及到的第一个关键酶，它催化Glc-1-P和ATP生成的ADP葡萄糖将作为淀粉合酶的底物参与直链淀粉和支链淀粉的合成(Okita, 1992)。研究表明，AGPase是淀粉合成的限速酶，与籽粒灌浆速率具有相关性(杨建昌等, 2001; Greene and Hannah, 1998; 潘晓华等, 1999)，但不影响淀粉的结构和组成(朱昌兰等, 2002)。导入AGPase基因的粳稻转基因株系的产量显著高于对照(高照等, 1999; 刘吉新等, 2001; 宋敏等, 2001)。研究发现将E. coli中编码AGPase的基因glgC-TM导入多个水稻品种，此基因编码的AGPase不受Pi抑制，而受3-PGA正调控，发现可以提高籽粒中淀粉的合成，并改进水稻产量性状(林鸿生等, 2002)。高等植物中的AGPase是由2个大亚基和2个小亚基构成的异型四聚体，此酶催化部位位于小亚基，而调节部位位于大亚基上(Smith-white and Presis, 1992)。在不同的水稻品种中小亚基基因(AGPsma)可分为4种等位基因(田志喜等, 2010)。

本研究以包括籼稻和粳稻亚种的亚洲栽培稻和AA、CCDD基因组的野生稻为实验材料，基于PCR技术，分析了不同水稻种质间ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因(以下简称AGPsma) PCR片段的特点，为发掘淀粉合成方面的优异水稻种质提供理论参考。

1结果分析
1.1 AGPsma的PCR扩增结果及序列相似性分析
AGPsma的PCR引物在元江野生稻、93-11、南34和榆密15这4份种质材料中扩增出2个片段，其大小分别为184 bp和215 bp (图1)。这4个种质材料扩增出的片段与NCBI登记的9308和苏御糯这2个品种的序列的相似度最低达99%，最高达100%。其中元江野生稻与品种9308的序列比对相似度为100% (图2)；榆密15与品种9308的相似度与元江野生稻与这一品种的相似度相同(图3)；93-11与品种9308相似度为99% (图4)；南34与品种苏御糯的相似度分别为100% (图5)。结果说明本研究所用PCR引物得到的这2个片段均为AGPsma的序列。

 
1.2 AGPsma PCR片段序列比对及序列聚类分析
对元江野生稻、93-11、南34和榆密15这4份种质的AGPsmaPCR片段序列比对后发现：水稻的不同种质间在该基因的序列上发生较大分化。(1)元江野生稻与榆密15、93-11、南34的相似度分别为100%，99.54%和85.19%；南34与93-11的相似度为85.65%。(2)元江野生稻和榆密15与南34和93-11相比，在109 bp处，存在一个T/C碱基变化，元江野生稻和榆密15为T，南34和93-11为C。(3)在121~151 bp处，南34缺失一个31个碱基的序列，其它三个材料均有该序列(图6)。从聚类结果来看，元江野生稻和榆密15聚合在一组，南34和93-11聚合在另一组(图7)。
 

 
1.3 AGPsma的序列分化
本研究用AGPsma PCR引物在所有的供试材料中共检测出A和B两种等位基因(图8)。据此所有的供试材料可分为3类，其中2类为A或B纯合体，个别材料为杂合体(表1)。第一类具有216 bp大小的条带，记为A型，此类型有196个材料，包括了大多数材料，有20个野生稻材料，38个籼稻，还有138个粳稻。在这类中，籼稻样本数占籼稻总样本数的95%，另有籼稻地方品种共6个，占籼稻地方品种总数的75%；粳稻数占粳稻总数的83.6%，另有地方品种共3个，占粳稻地方品种总数的60%；第二类具有185 bp的条带，记为B型。此类型有28个材料，包括2个籼稻地方品种和26个粳稻，其中有2个粳稻地方品种。第三类材料为杂合型，同时具有216 bp和185 bp的带型，记为C型，此类型有1个材料杂交粳稻滇杂35。由此可见，AGPsma序列在野生稻中可能尚未出现分化，但在籼稻、粳稻和地方老品种及改良品种中都出现了遗传分化。
 

 
2讨论
本研究所得到的AGPsma片段与已报道的AGPsma的DNA序列比较，发现本研究所克隆的AGPsma片段与它们有很高的相似度，说明在不同类型水稻或品种间AGPsma的保守性是非常高的。通过序列比对后发现，AGPsma的片段序列在野生稻和栽培稻间，籼稻与粳稻间有差异，此差异暗示着它们在决定蛋白质序列、结构和AGPase功能方面可能是有差异的，但是这种序列变异是否与该基因的功能有关还有待于进一步研究。改良品种的杂交粳稻恢复系南34和杂交粳稻保持系榆密15同样有明显的遗传差异，两者的相似度仅为85.19%。这结果说明在常规的育种工作中，由于选用的亲本不同和育种目标的不同可导致改良品种间遗传差异明显。

本研究中野生稻的PCR带型全部属于A型，而籼稻样本总数的95%和籼稻地方品种总数的75%都属于A型，说明本研究中的野生稻材料可能与籼稻存在更近的遗传亲缘关系。本研究中，在AGPsma上，地方品种中不论是粳稻还是籼稻PCR带型在A型和B型中均存在，而籼稻的改良品系PCR带型只具有A型，说明地方品种受到的人工选择压力可能小于改良品种(系)。亚洲栽培稻的栽培和驯化经历了一万多年的历史(Normile, 1997)，在自然选择和人工选择的共同作用下，在适应不同生态类型的过程中形成了众多的地方品种和改良品种，随之亚洲栽培稻在基因组序列上发生了大规模的变异(蔡星星等, 2006)，这种变异究竟是人工选择的强大压力导致的还是在栽培稻驯化之前产生了这种变异，还值得进一步研究。

前人的研究主要集中于对AGPase基因的表达研究(Levi and Preiss, 1976; Anderson et al., 1991; Weber et al., 1995; La Congnata et al., 1995)。瞿礼嘉等(1995)和宋波涛等(2005)分别对水稻AGPase基因和马铃薯AGPsma进行cDNA克隆和序列分析及表达分析。本研究是提取水稻总DNA直接进行PCR扩增，并对AGPsma PCR片段进行克隆分析，从而研究AGPsma PCR片段的特点。本研究得到的2个AGPsma PCR片段与田志喜等(2010)和谢会兰(2007)的研究一致，但是他们的研究主要是关于AGPsma与水稻品质的关系研究。本研究主要是分析AGPsma在不同类型水稻材料间的序列差异。本研究结果表明AGPsma在不同类型的水稻间存在不同，说明本研究中的水稻种质在这一功能基因的利用上有很大的潜力，因此本研究结果可为有效利用和开发新的种质资源提供参考信息。

3材料与方法
3.1实验材料与试剂
本实验材料包括来自于不同国家和地区的野生稻20份，其中AA基因组野生稻有15份、CCDD基因组野生稻有5份，和205份亚洲栽培稻品种(系)，其中籼稻有40，地方品种有8份、粳稻有165份，地方品种有5份(表1)。

实验所用的试剂：琼脂糖DNA回收试剂盒和LB培养基均购自上海生工生物有限公司；克隆载体pEASY^TM-T1 Smiple Cloning Vector和Trans1-T1感受态细胞均购于北京全式金生物技术有限公司；DNA Marker BM2000购于昆明硕阳有限公司。

3.2实验方法
3.2.1 DNA的提取
采用改良的CTAB法提取水稻单株叶片的总DNA (Murray and Thompson, 1980)

3.2.2 PCR扩增
AGPsma的PCR扩增引物来自于文献(田志喜等, 2010)。引物序列为F：5''-TACGCTATGCTCTTGA- AAC'-3'，R：5'-TATCTTCCCAGTAACCATCA'-3'。引物PCR反应体系：20 μL总体积中包含DNA模板，10× PCR Buffer，dNTP (2.5 mmol/L)，20 pmol引物(20~40 ng)，Taq E (5 U/μL)，加水至20 μL。PCR反应条件：首先94℃预变性4 min；然后94℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，45个循环；最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，照相。

3.3 PCR产物的克隆与测序
克隆测序的DNA分别来自元江的普通野生稻(以下简称元江野生稻)、籼稻品种93-11、籼粳交偏粳品种南34以及粳稻品种榆密15的PCR产物。使用琼脂糖DNA回收试剂盒回收目的片段，取2 μL回收产物和1 μL pEASYTM-T1 Smiple Cloning Vecto及2 μL ddH₂O室温下连接10 min。加连接产物于50 μL的Trans1-T1感受态细胞中转化，菌落PCR检测阳性，将阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。同一目的PCR片段选取6个克隆，用通用引物M13测序。

3.4 数据分析
序列比对在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行、用DNAMAN软件分析材料间DNA片段序列差异并对供试材料进行聚类分析。以元江野生稻、93-11、南34和榆密15作为基本参照，对AGPsma引物在所有的225份材料中扩增出的条带进行统计分析。

作者贡献
赵颖和谭学林是本研究的实验设计和实验研究的执行人；赵颖和朱高倩完成数据分析，论文初稿的写作；孙朝华参与DNA的提取，金寿林参与实验材料的种植和管理工作；谭学林是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由云南省科技攻关重点项目(2009BB007)资助。

参考文献
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