甜瓜(Cucumis melo L. var reticulatus Nand.)为葫芦科(Cucurbitacleae)甜瓜属(Cucumis)一年生草本植物，是一种重要的园艺作物。随着设施栽培面积的东移南扩，甜瓜设施栽培面积逐渐扩大，但连年种植造成的大幅度减产、土传病害、土壤盐分积累等问题严重制约着其大面积种植和生产，而嫁接成为克服这些障碍的首选之举。近年来蔬菜嫁接在世界范围内的应用已越来越广泛(Cantliffe, 2009)，尤其在葫芦科作物黄瓜、甜瓜、西瓜、西葫芦等作物上使用效果明显，且嫁接能显著提高作物的耐逆性(Estañet al., 2009; 张古文等, 2006; 2007)、抗病性(Lee and Oda, 2003; Stegemann and Bock, 2009)解决连作障碍，获得高产和稳产。

目前，SSR (simple sequence repeat, 微卫星标记)、AFLP (amplified fragment length polymorphism, 扩增片段长度多态性)、SRAP (sequence-related amplified polymorphism, 相关序列扩增多态性)等分子标记技术已飞速发展，利用各种DNA分子标记技术研究各种植物的遗传机理也成为近年来分子生物学领域的研究热点。目前开展的分子标记基本上都是以PCR为基础的DNA多态性检测技术，鉴于多态性高、重复性好、遗传信息量大、稳定性好、测序方便等优点，在分子标记辅助育种中有着很大的应用前景。近年来对于嫁接亲和性分子标记方面的研究鲜有报道，以甜瓜接穗开展的研究则更少。

本实验以两种嫁接亲和性差异明显的甜瓜接穗自交系为研究材料，配制F_2:3群体并构建亲和性优、差DNA池，采用BSA法(bulked segregate analysis, 分离群体分组分析)筛选两池中具有多态性的引物，以期获得与甜瓜嫁接亲和性有关的分子连锁标记，进而辅助选择嫁接亲和性优良的甜瓜品种，同时为其嫁接亲和性基因定位、克隆及揭示嫁接这一古老而特殊的栽培操作内在分子机理奠定基础。

1结果与分析
1.1亲和性调查
亲和性调查发现不同嫁接组合之间嫁接株成活率、坐果率、果实品质有差异(表1)。其中，甜瓜接穗85-1与南瓜砧木“壮士”的亲和性表现优(0级)，与自根苗相比嫁接株成活率高达99%，坐瓜率为100%，果实甜度无变化、整体品质与对照相当；而B717嫁接成活率仅为40% (3级)，坐瓜率56%，甜度比对照降低2.8%、整体品质表现较差。这表明甜瓜自交系85-1与南瓜砧木“壮士”的嫁接亲和力较高，而B717嫁接亲和力较差。F₃家系中各接穗得到嫁接苗(F₂对应单株做对照)，在嫁接亲和力(成活率、坐瓜率、果实甜度)表现出一定的分离变化见表1。
 

表1 不同嫁接组合亲和性调查 Table 1 The investigation of grafting compatibility between different combination

1.2 DNA质量检测
将所提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测(图1)。由图可以看出，无论是嫁接亲和性优良的85-1，还是嫁接亲和性较差的B717，提取的DNA均主带清晰，质量较好。
 

图1 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量 Figure 1 DNA Quality test by agarose gel electrophoresis

1.3引物筛选
通过750对引物对亲和性优差池的筛选发现，共有382对引物在两份甜瓜亲本材料间呈现多态性，占检测引物总数的的50.93%，其中9对引物(Y1(CMN-0616), Y2(M103), Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9)在亲和性优良池和亲和性较差池中检测出差异片段，呈现显著差异，占检测引物的1.20%。9对差异标记的引物扩增图谱(图2)。其中4对引物在嫁接亲和性良好的85-1中都扩增出条带，而在嫁接亲和性较差的B717中均未扩增出条带；另5对引物情况与之相反(图2)，在嫁接亲和性较差的B717中都扩增出条带，而在嫁接亲和性良好的85-1中均未扩增出条带，且这9对引物在亲和性差异明显的两个品种间扩增出的差异片段均在500~750 bp之间。
 

图2 9对引物对两个池的扩增图谱 Figure 2 DNA pools amplified with nine pairs of primers

另外，对扩增引物的筛选过程中还发现有373对引物在嫁接亲和性良好的85-1和嫁接亲和性较差的B717中扩增出相同条带，其中有351对引物在亲和性差异明显的两个品种间扩增出的相同条带在200~1 000 bp之间，占总相同条带的94.1%；而另外22对引物在两品种间扩增出大约1 100 bp的条带，占总相同条带的5.9%。368对引物在亲和性差异显著的两品种间未扩增出片段(图2)。

 1.4 标记计算与验证
用所得到的9对引物对F2群体单株进行了验证。结果显示，Y1 (CMN-0616)和Y2 (M103)与嫁接亲和性性状遗传距离分别为17.6 cm和9.3 cm；通过标记扩增和实际实验比较，分子标记辅助鉴定准确率在90%以上。由图3可以看出，这两对引物用于扩增所选F2代亲和性优差个体DNA，进行标记的稳定性验证。
 

图3 引物Y1 (CMN-0616)和Y2 (M103)在部分F2单株中的验证 Figure 3 Verification of primer Y1 (CMN-0616) and Y2(M103) in part of F2 individual plants

2讨论
目前嫁接栽培已经在我国西甜瓜大田生产中得到了广泛应用，尤其在我国南部海南省、中部厚薄皮混杂种植区(江苏南通及长三角地区, 安徽和县, 河南洛阳等)、黄河以北的薄皮甜瓜区等应用较多。近年来，甜瓜嫁接研究已经从以往的单纯生理方面深入到分子水平，研究内容也相应的从简单的提高植株抗逆性、提高产量等方面扩展到具体的嫁接基因亲和性方面，从对薄皮甜瓜的大量研究(齐红岩, 2010; 陈友根等, 2008)延伸到厚皮甜瓜上，在以往筛选优良砧木接穗组合、考察嫁接植株生长发育状况的基础上，进一步探讨嫁接植株间的分子机理；与此同时，导致不同砧木接穗嫁接组合表现不同嫁接优势的原因以及嫁接能够提高作物抗逆性、提高产量的具体过程是什么，具体机理是如何运作的等一系列问题也一直令广大学者百思不得其解。

目前，各种分子技术在葫芦科作物上已经开展了诸如种质亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、基因标记与转基因等方面的研究，且随着SSR、AFLP、ISSR和SRAP等技术的不断成熟，其应用在各个研究、各个领域仍在逐步扩大。张桂华等(2004)借助分子标记对育种材料从DNA分子水平上进行选择，标记了与黄瓜白粉病抗性相关基因连锁的AFLP标记，连锁距离为5.56 cm，从而更有效地筛选高产高抗优质品种，提高育种效率。陈飞雪等(2008)用黄瓜耐高温自交系863-7和不耐高温自交系863~6构建F2群体寻找与黄瓜耐高温连锁的分子标记，用62对SSR引物和132对SRAP引物进行多态性筛选，结果8对SSR引物和71对SRAP引物呈现出多态性。本研究选取与南瓜砧木嫁接亲和性差异明显甜瓜自交系85-1和B717杂交产生F_2:3群体，并通过调查遗传群体中嫁接植株成活率、坐果率、果实甜度等指标进行亲和性考察，使用成熟BSA法筛选嫁接亲和性相关基因连锁标记时，方法简单、直观，研究结果具有可靠性。

嫁接亲和性分子机理的进一步分析为植株间高效嫁接、利用嫁接优势更好的服务于农业生产提供重要的意义和价值，该领域目前国内研究较少，若能找到嫁接亲和性连锁距离更近的相关标记，将会为甜瓜或者葫芦科植物嫁接研究带来重大突破。本实验筛选的2对引物初步将两个甜瓜嫁接亲和性差异明显的材料区分开来，至于这些标记能否用于甜瓜大批量的嫁接鉴定，还需进一步验证。有关葫芦科作物嫁接分子标记辅助选择，还需借鉴其他分子技术进一步筛选，总之更多的嫁接相关分子机理研究正蓄势待发。

3材料和方法
3.1实验材料
南瓜砧木“壮士”品种以及甜瓜接穗自交系85-1和B717，均由上海市农业科学院园艺所提供。课题组预实验表明，85-1为与“壮士”嫁接亲和性较好的自交系，B717为与“壮士”嫁接亲和性较差的自交系。以85-1和B717为亲本组配F2:3家系群体(F₂包括126个单株)。

3.2亲和性分级和调查
亲和性分级主要采用3个指标分别是嫁接成活率、坐瓜率和果实甜度。亲和性分级为： 0级别：亲和性优，群体嫁接成活率95%以上或单株成活、坐瓜率100%以上、果实甜度与对照相差0.5%以内；1级别：亲和性良，群体嫁接成活率85%~95%以内或单株成活、坐瓜率83.3%~95%以内、果实甜度与对照相差0.5%~0.8%以内；2级别：亲和性中，群体嫁接成活率70%~85%以内或单株成活、坐瓜率66.7%~83.3%以内、果实甜度与对照相差0.8%~1.2%以内；3级别：亲和性差，群体嫁接成活率70%以下或单株死亡，坐瓜率66.7%以下、果实甜度与对照相差1.2%以下。

调查过程为：以85-1和B717为亲本产生F₃群体中每个家系取一个植株苗作接穗分别与砧木“壮士”采用插接法嫁接[以自根苗(85-1, B717及其由它们为亲本产生F₂各单株)作为对照]；分别于4月20日和4月27日播种接穗和砧木，5月11日进行嫁接。5月23日调查嫁接植株成活率，定植于日光温室中，高畦栽培，每畦定植双行，株距40 cm，黑色地膜覆盖，采用滴灌方式浇水；6月23日调查坐瓜率，7月25日考察果实的甜度。

3.3亲和性优差池的建立、DNA的提取和检测
插接操作中将甜瓜接穗上被切下的根和茎材料搜集于-80度储存备用。调查各嫁接苗成活率、坐瓜率、果实甜度亲和性指标并做对应亲和性级别划分。搜集甜瓜接穗中表现亲和性优(0级)和亲和性差(3级)的对应F₂植株DNA各10份，分别随机各取6份单独混合建成亲和性优、差DNA池各3个。

DNA提取方法使用改良的CTAB方法，用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。

3.4 PCR扩增和电泳检测
反应体系：25 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL (生物公司提供) (10×Buffer (含20 mmol/L的Mg²⁺); 0.5 μL dNTPs (2.5 mmol/L)；0.2 μL EasyTaq DNA聚合酶(2.5 U/μL))；40.5 ng/μL的模板DNA 1 μL；前后引物(30 ng/μL)各1 μL；最后加入9.5 μL ddH₂O补齐。PCR反应在基因扩增仪(生物科技公司生产)上进行。PCR反应程序：94℃预变性3 min；然后94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃再延伸5 min，4℃保存待测。扩增产物用1.5%~2%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，100 V恒压下1×TAE缓冲液中电泳90 min左右，紫外灯下观察记录带型并拍照。

3.5引物筛选
由上海生工合成文献发表的750对SSR、AFLP、SRAP引物(Fernandez-Silva et al., 2008; Fukino et al., 2008; Ren et al., 2009)对亲和性优差池进行筛选。

作者贡献
陈亚丽和刘龙洲是本研究的实验设计和实验研究的执行人；陈亚丽完成数据分析，论文初稿的写作；刘龙洲和朱为民参与实验设计，试验结果分析；刘龙洲、朱为民、郭世荣和陈幼源是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改，参与了论文的校对和定稿等。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31000915)、上海市重点学科(蔬菜学-交通大学)建设项目(B209)和上海市启明星人才计划(11QA1405700)共同资助。作者感谢上海市农业科学院园艺所提供实验平台，能够进行各项试验、完成本研究工作，在此深表感谢。

参考文献
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