木质素是植物体中一种重要的组成成份。木质素的存在一方面增强了植物体的支撑能力，但另一方面也给一些工业加工过程带来不便。尤其是在造纸工业中，除去木质素所用的化学试剂是造成环境污染的主要因素。因此，一直以来，研究人员致力于木质素代谢调控的研究，希望培育出满足不同利用要求的植物新品种。在植物木质素的生物合成过程中有一系列的合成酶在发挥着重要作用，COMT就是其中之一。研究人员从不同植物中分离到多个COMT基因。将COMT基因反向转入杨树中，导致了转基因杨树木质素含量的下降和成分的改变(Lapierre et al., 1999; Jouanin et al., 2000; 赵华燕等, 2002,科学通报, 47(6): 604-607)。在转反义COMT基因的烟草(Ni et al., 1994)、苜蓿(Guo et al., 2001)和杨树(Dwivedi et al., 1994)中都发现，S型木质素含量下降较多，而G型木质素含量下降较少，而Klason木质素含量的变化趋势则不完全一致，有的基本没什么变化，有的却降低，对这种现象目前还没有确切的解释。Doorsselaere等(1995)指出这种情况与检测木质素含量的方法有关，Atanassova等(1995)则认为可能与COMT活性被抑制的程度有关。

竹子在人们的生产和生活中应用非常广泛，其木质素含量及组成成分直接关系到竹产品的品质。目前从竹子中克隆到与木质素生物合成相关的基因还比较少，只有毛竹的C3H、CCR、CAD、F5H-like (杨学文等, 2009; 杨学文, 2009)、黄古竹的PAL (杨学文等, 2009)、慈竹的4CL (周建英等, 2010)等有限几个。绿竹属丛生竹类，在我国华东和华南分布较多，是笋材两用竹种。竹笋中的木质素含量对口感影响很大，而竹材中木质素含量也直接影响到竹材的机械强度。本文将从绿竹叶片中克隆到的BoCOMT1基因反向导入烟草中，进行了相关分析并对基因功能进行了初步验证。

1结果与分析
1.1转基因烟草的PCR检测
经抗性培养基筛选获得的转基因烟草，经过PCR检测进一步筛选阳性植株(图1)，共获得7个阳性转基因株系。
 

图1 转基因烟草的PCR检测 Figure 1 The PCR identification of transgenic tobacco

1.2转基因烟草的表型分析
在经过筛选获得的7个转基因株系中，表型上存在较大差异，其中4个株系与对照没有明显差异，基本与对照同时开花，而另外3个株系则生长比较矮小，高度仅为对照的一半，且茎杆也明显较对照细弱，幼苗期呈倒伏状，没有开花现象。

1.3转基因烟草与对照茎杆颜色的比较
将转基因烟草与对照在相同的环境条件下进行培养，成熟后将基部茎段切下，去皮，比较两者之间的颜色差异。结果如图2所示，与对照相比，转基因烟草茎杆下部呈现淡红色，而对照基本为白色。将两种茎段在空气中自然干燥，转基因烟草茎段的颜色越来越淡，而对照没什么明显变化，完全风干之后，两种茎段的颜色都不再发生改变。
 

图2 对照与转基因烟草茎杆颜色的比较 Figure 2 Comparison of stem color between control and transgenic tobacco

1.4 Klason法测定转基因烟草中木质素的含量
利用Klason法测定转基因烟草木质素的含量，结果显示，在所有7个株系的转基因烟草中Klason木质素含量较对照都有下降，但程度各有不同。总的来说，与对照表型接近的4个株系木质素含量下降较少，而生长矮小的3个株系下降较多，其中下降最多的达到了28.7%。

2讨论
木质素是植物细胞壁的重要组成成分，构成纤维支架，具有增强植物体机械强度的作用,也有利于提高细胞的运输能力。通过转基因抑制木质素生物合成酶的活性可以达到降低木质素含量的目的，但有时也会对植物的生长发育带来不良影响，造成植株生长矮小，细胞壁变薄等。在转反义PAL基因的烟草中，当PAL活性下降到1/3以下时，转基因植株就表现出矮化现象(Boerjan et al., 2003)。Wagner等(2009)也报道当辐射松中4CL酶活性受到严重抑制时，会导致它象盆景一样矮小。本文的研究中也出现了转基因植株矮化的情况，推测应该是木质素含量的降低影响了细胞壁的合成，继而营养成分的运输减少，从而使生长受到抑制。

转基因烟草与对照相比，在茎杆基部的颜色上存在比较明显的差异。去掉外皮后，转基因烟草的茎杆基部呈淡红色，而对照基本为白色。这种现象在其他转木质素合成调控酶基因的植物中也有发现。例如杨树在转入反义COMT基因(Doorsselaere et al., 1995)或4CL基因(贾彩虹等, 2004)后，茎杆也都显现出或深或浅的淡红色，而且颜色的深浅与木质素含量下降的多少有一定的关系，木质素含量下降越显著，淡红色就越深。这种现象在其他一些人的研究中也有报道(Zhong et al., 2000; Piquemal et al., l998; Halpin et al., 1994)。

许多研究结果已经表明，COMT基因的表达被抑制后，木质素的生物合成受到影响，导致木质素的含量或组成发生改变，本文的研究结果也证实了这一点。但木质素组份与含量的变化与COMT被抑制的程度是否存在相关性还不是很清楚，这方面的研究结果并不是一致的。在Sewalt等(1997)和Ni等(1994)的研究中，COMT活性被抑制越高，转基因植株木质素含量下降越多。但也有一些人的研究不支持这种变化趋势，Doorsselaere等(1995)、Lapierre等(1999)和Tsai等(1998)都发现，转基因植株的木质素含量与COMT活性被抑制程度没有关系，即使COMT活性被抑制达到70%时，木质素含量却没有明显变化。

3材料与方法
3.1转化材料
烟草组培苗，品种为红花大金元。

3.2反义表达载体的构建
 通过PCR扩增在BoCOMT1基因两端分别加上XbaⅠ和KpnⅠ识别位点，然后反向插入同样带有这两个识别位点的植物表达载体PBI121中(图3)，经过酶切验证后，利用电击法将质粒转入农杆菌中。
 

图3 BOCOMT1基因插入植物表达载体PBI121的示意图 Figure 3 A diagram of BOCOMT1 gene inserting into plant ex- pression vector PBI121

3.3烟草的叶盘法转化及转基因植株的培养
先将烟草在25℃培养室中进行无菌培养，然后挑选生长状态良好的叶片，剪成1 cm²的小块，在农杆菌液中浸染3~5 min。取出后用滤纸吸干，在分化培养基上使其分化出烟草幼苗。然后转到生根培养上进行生根诱导，形成一个完整的转基因植株。当转化的烟草幼苗长到2~3 cm时，将其转移到培养钵中继续培养。

3.4转基因烟草的PCR检测
以CTAB法提取对照及转基因烟草的基因组DNA，然后利用PCR方法检测目的基因是否已经转入烟草的基因组中。

3.5转基因烟草木质素含量的测定
按照国标GB/T 2677.8-1994测定木粉中酸不溶木质素的含量。

作者贡献
李雪平是本研究的试验设计和实验研究的执行人，完成数据分析及论文初稿写作；彭镇华指导试验设计，数据分析，论文写作与修改；高志民、胡陶参与部分试验结果分析。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
感谢河北农业大学陈段芬教授在实验过程中的帮助。

参考文献
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