低温胁迫是植物栽培中常遇到的一种灾害。由于低温在植物整个生育过程中均会造成不利影响，严重影响植物的正常生长，降低植物的品质及观赏性。因此，提高植物抗低温的能力成为解决如冷害造成的植株苗弱、生长迟缓、品质下降等问题的重要方法之一。

目前，随着现代生物技术的发展，通过植物基因工程将特异基因导入植物，在不改变原有优良性状的基础上提高植物的抗逆性，已经在多种植物上获得成功，但关于花卉抗性基因工程方面的研究报道并不多(李静和车代弟, 2004; 李美如等, 2003)。

美女樱(Verbena nybrida)是马鞭草科马鞭草属多年生草本花卉，其恣态优美，花色丰富，色彩艳丽。美女樱株丛矮密，花繁色艳，花期为5~11月，由于花期长可用作花坛、花境材料,也可作盆花大面积栽植于园林隙地、树坛中(包满珠, 2005, 中国农业出版社, pp.193-194)。但是美女樱的耐寒能力较弱，且高温高湿的环境下易发生如白粉病、霜霉病的病害、抗性较弱，本研究通过基因工程的方法来改良其抗寒性。

硅是地壳和土壤中含量第二丰富的元素，被认为是植物生长发育的准必需元素。绝大多数的植物组织中都含有硅(李莉等, 2010)。植物体中可溶性硅能提高植株抗寒抗旱、防治病虫害和抗倒伏的能力，激发多个防御反应机制(房江育和马雪泷, 2005)。据报道，在水稻中克隆出一类硅转运蛋白基因(陈虞超等, 2009)，与硅在植物中的转运及利用有关。其中Lsi1 (Low silicon rice 1)基因主要负责编码参与植物对土壤中硅的吸收的硅转运蛋白；Lsi2 (Low silicon rice 2)基因主要负责编码硅从植物中释放到外界的硅转运蛋白，这两个基因相辅相成维持植物体内硅的平衡。

本研究将硅转运蛋白基因OsLsi1和OsLsi2转入美女樱中, 研究该基因对美女抗寒性的影响。对经PCR鉴定的阳性转基因美女樱植株进行RT-PCR检测，结果表明硅转运蛋白基因OsLsi1和OsLsi2在美女樱中能够正常转录并表达，说明这两个基因已经整合到美女樱中，之后进行低温处理并测定相关生理指标，研究转基因美女樱的抗寒性，也为创建美女樱抗寒种质资源奠定基础。

1结果分析
1.1转OsLsi1基因抗性植株的PCR及RT-PCR检测
对获得的51株再生植株用CTAB法提取DNA,以待测转基因植株叶片DNA为模板，OsLsi1基因质粒为阳性对照，未转化的美女樱叶片DNA和水分别为阴性对照和负对照，使用OsLsi1基因特异引物进行PCR 扩增,转基因植株可扩增出约1 200 bp的目的片段，而未转化植株的无扩增条带(图1)，其中检测出26株为阳性植株，阳性率为70 %，初步证明了OsLsi1基因已经整合到美女樱中。
 

 
RT-PCR检测结果如图2所示，观察到阴性对照无扩增带，而阳性对照和转基因PCR呈阳性的植株均能扩增出约1 200 bp的目的片段，与之前PCR检测的结果一致，说明OsLsi1基因已经整合到美女樱中。
 

1.2转OsLsi2基因的PCR及RT-PCR检测
对获得的60株再生植株用CTAB法提取DNA，以待测转基因植株叶片DNA为模板，OsLsi2基因质粒为阳性对照，未转化的美女樱叶片DNA和水分别为阴性对照和负对照，使用OsLsi2基因特异引物进行PCR扩增，转基因植株可扩增出约1 715 bp的目的片段，而未转化的植株无扩增条带(图3)，其中检测出42株为阳性植株，阳性率为70%，初步证明了OsLsi2基因已经整合到美女樱中。
 

RT-PCR检测结果如图4所示，在对PCR检测初步证明42株阳性植株中，有32株转基因美女樱叶片的RNA在1 715 bp附近扩增出与质粒对照一致的条带，证明了目的基因已经整合到美女樱中。但有10株美女樱叶片的RNA没有得到转录，这说明在PCR在检测时出现了假阳性，同时也说明PCR检测只能作为转基因分子检测的初筛，进一步检测证明基因的转入是非常有必要的。
 

1.3低温胁迫下转基因美女樱相关生理指标的测定
1.3.1低温胁迫下转基因美女樱丙二醛(Maleic diald- ehyde, MDA)含量的分析
低温胁迫下丙二醛(MDA)能使酶失活并且对细胞膜等生物膜造成损伤，使其透性增大透性增大(李合生, 202, 高等教育出版, pp.415-419)。因此，MDA含量的高低反应出植物细胞抗氧化能力的强弱，间接反映出物细胞受损程度和植物抗寒能力。

检测发现，低温胁迫0~4 d时，CK、L2株系的MDA含量一直呈上升趋势，而L1株系呈先上升后下降趋势，1 d时L1株系MDA含量达到最高值，出现这种情况可能是由于，低温胁迫1 d时，转化美女樱的自身抵抗机制还没能完全启动，而在胁迫4 d时由于OsLsi1基因的转化对土壤中硅的大量吸收，使硅起到保护植物的作用，胁迫4~7 d时，CK、L1、L2株系的MDA含量也一直呈上升趋势，但CK、L2株系MDA含量都明显高于L1株系(图5)。与对照相比较，L2株系的MDA含量明显高于L1株系，由此可以推测，转OsLsi1基因美女樱的抗寒能力比转OsLsi2基因美女樱抗寒能力高。
 

通过多重比较分析发现(表1)，在低温胁迫0 d时，CK与L2株系差异并不显著，而L1株系与CK、L2株系相比差异性显著。在胁迫1 d时，三个株系差异性均不显著，而在胁迫4 d以后一直保持着显著地差异性。
 

由此说明，OsLsi1基因的导入可以显著降低低温胁迫的美女樱MDA的含量，植物的抗寒能力有所提高；相反，OsLsi2基因的导入可以提高低温胁迫美女樱的MDA的含量，使植物抗寒能力降低，间接证明硅可以提高植物抗寒能力。

1.3.2低温胁迫下转基因美女樱脯氨游离酸含量的分析
游离脯氨酸是一种小分子渗透调节物质，是水溶性最大的氨基酸。植物在逆境胁迫条件下，均积累高水平的脯氨酸(朱虹等, 2007)。

检测发现，低温胁迫0~4 d时, CK、L1株系的游离脯氨酸的含量一直呈上升趋势，4 d时CK株系达到最高值，之后呈下降趋势；胁迫4~7 d时, L1株系的游离脯氨酸含量一直是上升趋势，且在7 d出现峰值，而L1、L2株系的游离脯氨酸的含量则呈下降趋势(图6)。与对照组相比较，L1株系的游离脯氨酸含量明显高于L1株系，由此可以推测，转OsLsi1基因美女樱的抗寒能力比转OsLsi2基因美女樱抗寒能力高。
 

经过多重比对发现(表2)，低温胁迫0 d时，CK株系与L1、L2株系呈现显著差异，L1与L2之间差异性不显著；在胁迫1 d、4 d、7 d时，三个株系都达到差异显著水平。由此推断OsLsi1基因可以提高美女樱体内游离脯氨酸的含量，从而提高植物的抗寒能力；OsLsi2基因的转入降低了游离脯氨酸的含量，使植物抗寒能力降低。
 

1.3.3低温胁迫下转基因美女樱SOD活性的分析
超氧化物歧化酶(SOD)是一种植物体内重要的酶类，其活性与植物的抗寒能力密切相关，可以反映出物对逆境的适应(史雨刚等, 2007)。

检测发现，低温胁迫0~4 d时，CK、L1、L2株系的SOD活性都呈上升趋势；胁迫4~7 d时L1株系一直是上升趋势，且在7 d出现峰值，而L1、L2株系的SOD活性则呈下降趋势。与对照相比较，L1株系的SOD活性明显高于L2株系，由此可以推测，转OsLsi1基因美女樱的抗寒能力比转OsLsi2基因美女樱抗寒能力高(图7)。

经过多重比对发现(表3)，低温胁迫0 d时，CK与L1、L2株系呈现显著差异；低温胁迫1、4、7 d时，CK与L1、L2株系也呈现显著差异，L1和L2株系在低温胁迫4 d后SOD活性均呈现下降趋势。由此分析可以说明，OsLsi1基因可以使美女樱SOD酶系统不受破坏，从而提高美女樱对低温的抵抗力；而OsLsi2基因导致SOD活性降低，使美女樱抗寒能力降低。
 

1.3.4低温胁迫下转基因美女樱POD活性的分析
POD与SOD相似，也是植物防御膜质过氧化机制中其重要作用的保护酶，有研究表明，POD的活性与植物抗寒能力呈正相关。

检测发现，低温胁迫0~4 d时，CK株系POD活性呈先上升后下降趋势，L1株系的POD活性呈上升趋势，而L2株系则一直保持下降趋势；胁迫4~7 d时L1株系一直呈上升趋势，且在7 d出现峰值，而L1、L2株系的POD活性则呈下降趋势。与对照相比较，L1株系的POD活性明显高于L2株系，由此可以推测，转OsLsi1基因美女樱的抗寒能力比转OsLsi2基因美女樱抗寒能力高(图8)。
 

经过多重比对发现(表4)，低温胁迫0 d时，L1与CK、L2这两个株系差异并不显著，CK与L2差异性显著；但随着低温胁迫天数的增加，三个株系POD活性均出现差异性显著，在胁迫4 d时达到极显著水平。由分析可推测，OsLsi1可能保护了植物体内的抗氧化系统不受破坏，从而增加了植物体内SOD、POD等保护酶类对活性氧清除能力；相反OsLsi2促使抗氧化系统的伤害，降低植物抗寒能力。
 

 
2讨论
在对抗性植株分子检测时，PCR一直是重要检测方法之一。其反应体系较小，成本低而且灵敏性好，但是PCR是在DNA水平上对外源基因进行检测极易出现假阳性，本文利用根癌农杆菌介导的方法将OsLsi1基因和OsLsi2基因转化到美女樱中，转OsLsi1基因的美女樱RT-PCR检测与PCR检测结果一直。但是转化OsLsi2基因的60株美女樱中经过PCR检测其中42株为阳性植株，后期运用RT-PCR对呈阳性的42株植株进行检测，发现只有32株呈阳性，这说明在PCR检测时出现了假阳性。由此可以看出，对转化植株进行分子检测时，还需要Southern杂交、Northern杂交、Western杂交等更精确的检测手段进行更进一步的检测，来确定目的基因是否已经整合到受体植株中(贺熙勇等, 2008)。

低温是限制植物分布影响产量的主要原因，对植物冷害机理的研究表明：低温直接损伤膜结构，使膜脂及功能蛋白受到损伤，从而破坏细胞正常的生理生化过程，因此膜结构的稳定性与植物抗寒性直接相关，POD和SOD作为内源活性氧清除剂能够在低温逆境中清除体内过量的活性氧，维持活性氧代谢平衡，保持膜结构的稳定性。从而消除或减轻伤害;低温锻炼可使酶的活性增强，使植物免受低温伤害，因而在低温逆境中POD和SOD活性的水平与植物的抗寒性强弱有着十分密切的关系，并可作为植物抗寒性检测的生理指标(张钰等, 1998)。

实验结果显示，转硅转运蛋白基因OsLsi1植株的SOD和POD的活性均高于对照植株, 从而在低温胁迫下能够有效地清除细胞内过量的活性氧，保持膜结构的稳定性，表明转基因植株在生理生化水平上获得了有益的变异，并从生理生化水平上验证转基因植株抗寒性的增强。同时通过检测发现转OsLsi1基因的植株抗逆性明显强于转化OsLsi2基因的植株，可能是由于OsLsi1基因与植物从外界土壤环境中吸收硅有关，可以提高植物吸收硅的效率，增强植物抗逆能力；而OsLsi2基因与植物将自身的硅向外界环境释放有关，使植物抗逆能力减弱。

随着分子生物学技术的飞速发展，运用基因工程手段提高植物的抗逆性为抗性育种开辟了新途径(王侠礼, 2005, 北方园艺, 6: 14-15)。在大豆、玉米、棉花等农作物上(俞超等, 2008, 江苏农业科学, 4: 31-33; 曹桂艳和刘艳, 2001)，本研究利用农杆菌介导法将OsLsi1、OsLsi2基因转入美女樱中，经过分子检测之后测定相关生理指标，表明转基因美女樱的抗寒能力得到了进一步提高，对培育抗寒美女樱品种。

3材料与方法
3.1植物材料、质粒及农杆菌菌株
美女樱(Verbena nybrida nybrida)，取自东北农业大学园艺实验站。农杆菌GV3101，质粒pBI121由东北农业大学园林育种研究室保存。pGEM-T Easy Vector购自Promega公司。

3.2转基因植株(OsLsi1, OsLsi2)基因PCR、RT-PCR检测
移栽于温室的转基因再生植株长至10 cm高时,采用CTAB 法提取转基因植株的叶片总DNA，根据基因序列引物进行PCR扩增，OsLsi1基因序列引物，P1：5'-AGGGATCCTAGCCAGCCAGTGTTAGA-3'和P2：5'-TACGAGCTCACACGAACCACCAAGCAA-3'，OsLsi2基因序列引物P3：5'-AGGGATCCAGGTGGTGGTCGATCGAA-3'和P4：5'-TACG- AGCTCGCCAATTCAATTTCAAGCT-3'，PCR反应体系总体积为25 μL：模板DNA 1 μL (约100 ng) 2 μL，上、下游引物各1 μL，Taq (5 U/L) 03 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 2.5 μL，Mg²⁺ (25 mmol/L) 2.4 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH₂O 补足25 μL。

PCR反应程序：94℃预变性7 min，然后94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增后取10 μL产物进行电泳检测。

RT-PCR检测：采用硼砂SDS法提取RNA并进行检测，以反转录后产物为模板，对转OsLsi1基因、OsLsi2基因的植株进行RT-PCR检测，反应体系及反应条件同PCR检测体系相同。

3.3转OsLsi1、OsLsi2基因美女樱植株的低温胁迫抗性检测
3.3.1待测材料的低温处理
将未转基因与转基因植株分别栽种于营养钵中，待幼苗长至4~6片真叶时，进行0℃低温处理分别为0、1 d、4 d、7 d采样，每处理重复三次,然后测其相关生理指标。

3.3.2生理指标的测定
(a)丙二醛(MDA)含量的测定：硫代巴比妥酸法(邹琦, 2000, 中国农业出版社, 173-174)。

(b)游离游离脯氨酸(Pro)含量的测定：酸性茚三酮法(邹琦, 2000, 中国农业出版社, 161-162)。

(c)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：采用NBT法(李合生, 2003, 高等教育出版社, 191-205)。

(d)过氧化物酶(POD)活性测定：采用愈创木酚法(李合生, 2003, 高等教育出版社,191-205)。

上述实验均重复3次，并进行统计分析。

作者贡献
胡翠平、赵然和张美恒是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王秀刚、赵然和张焕完成数据分析；张美恒参与实验设计，试验结果分析；胡翠平和樊金萍是项目的构思着和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由黑龙江省研究生创新科研项目(YJSCX2011-072HLJ)资助。感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。

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