草地早熟禾(Poa pratensis L.)是北方最常用的冷季型草坪草，具有耐践踏、绿期长、坪观质量好等优点，但也具有耐旱性差、易感病、温度敏感等缺点。作为一种复杂的多倍体及兼性无融合生殖方式植物，利用传统育种技术如自然筛选、常规父母本杂交及理化诱导突变体等进行目的性状改造，周期长，且需要投入大量的人力、物力和财力。近些年来，一些实验室利用基因工程技术对早地早熟禾品种进行有针对性地目的性状改造获得成功(佘建明等, 2005; Chai et al., 2003; Gao et al., 2006)，显示出极大的潜力。

高效率的组织培养体系是进行基因工程育种中的重要环节。目前有部分实验室从一定层面对个别早熟禾品种开展了再生体系的研究，包括培养基的筛选(陈智勇等, 2007)、激素的优化(高丽美, 2007; 马晖玲等, 2009; 马忠华等, 1999; 麻冬梅等, 2008; 皮伟等, 2004; Valk et al., 1995)等。结果显示，不同品种的组培体系存在较大的差异，特别是植株分化再生环节。本研究拟对生产上常用的6个草地早熟禾品种再生体系进行系统研究，以期建立这些品种的高效再生体系，探讨早地早熟禾再生体系的特点，为进一步开展这些品种的基因工程育种奠定基础。

1结果分析
1.1不同品种草地早熟禾愈伤组织分化率比较
早熟禾的种子在诱导培养基上暗培养约40 d后，陆续产生白色或淡黄色的非胚性愈伤组织，其表面湿润，质地疏松且呈透明状。继代培养至2个月以后，愈伤组织颜色变为浅黄色，表面干燥且有颗粒状突起，体积增大至5 mm左右。挑选块状愈伤组织于分化培养基上生长，光照处理3周左右，部分愈伤组织上长出绿芽，转接到生根培养基后均能生根成苗(图1)；部分愈伤组织维持状态不变或长出白色的根毛，这些愈伤组织块均不能继续分化出小苗。
 

计算不同品种的分化再生频率发现，不同草地早熟禾品种间存在较大差异(表1)：有些品种容易分化和再生，如“帝王”、“超级伊克利”、“蓝鸟”等，在各种处理下都有愈伤组织分化和再生，而“盛宴”、“布鲁克”等则只在特定条件下才能分化和再生。再生率最高的是“蓝鸟”(60%)，其不同处理下分化再生频率的均值也达到了25.57%，其次为“超级伊克利”和“帝王”，再生率分别达到35.7%和46.7%，不同处理下的均值分别为23.20%和22.80%。
 

比较分化再生过程中的几种组合处理发现，不同处理对分化再生的频率影响很大。其中处理组合Ⅴ(2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D)适合于所有检测的品种，表明不同品种对这一组合处理的广泛适应性；而组合Ⅰ的表现最差，有一半品种没有分化，分化品种的分化率也都较低(10%以下)；组合处理Ⅳ和Ⅵ中虽然都有2个品种不能分化，但其它品种的分化率都较高，显示出品种差异对组合处理的敏感性。

1.2单独使用6-BA对草地早熟禾愈伤组织分化的影响
实验设计了2个浓度梯度，分别为2 mg/L和3 mg/L。由图2可以看出，不同品种草坪草品种的愈伤组织分化对6-BA比较敏感，其中，“盛宴”和“布鲁克”在单独使用6-BA时愈伤组织不能分化，“帝王”和“蓝鸟”愈伤组织的分化率随着6-BA浓度升高而增加，“超级伊克利”和“克尼尔沃特”则随着6-BA浓度升高而降低。
 

1.3 1 mg/L 6-BA基础上添加2,4-D对草地早熟禾愈伤组织分化的影响
1 mg/L 6-BA的基础上分别添加0.05 mg/L和0.1 mg/L 2,4-D，结果发现，补加较高浓度2,4-D会抑制“帝王”、“超级伊克利”的分化率，而在“克尼尔沃特”和“蓝鸟”中分化率稍有提高，对“盛宴”和“布鲁克”没有影响(图3)。
 

 
1.4 2 mg/L 6-BA基础上添加2,4-D对草地早熟禾愈伤组织分化的影响
于2 mg/L 6-BA下加不同浓度2,4-D (0, 0.1 mg/L和0.2 mg/L)，发现不同品种品种的反应不同：较高浓度2,4-D时(0.2 mg/L)能促进“帝王”和“蓝鸟”的分化，无2,4-D时能促进“超级伊克利”和“克尼尔沃特”的分化，而补加0.1 mg/L 2,4-D则使得分化难度较大的的“盛宴”和“布鲁克”出现了分化(图4)。
 

 
1.5 0.1 mg/L 2,4-D与6-BA组合对草地早熟禾愈伤组织分化的影响
于不同浓度6-BA下添加0.1 mg/L 2,4-D，分析对不同品种草地早熟禾愈伤分化的影响。结果表明(图5)，所有测试品种在最高6-BA浓度时表现最好，如“蓝鸟”使用2 mg/L的6-BA比使用0.1 mg/L和1 mg/L的6-BA，分化率均值都提高了近4倍；并且6-BA浓度低时，一些品种如“盛宴”、“布鲁克”等甚至不能有效分化。
 

 
2讨论
本研究通过6-BA和2,4-D的配比组合实验，建立了6个草地早熟禾品种愈伤组织细胞分化和植株再生体系。结果表明，6个品种的植株再生率存在较大差异，介于3.33%~60%之间，“帝王”、“超级伊克利”和“蓝鸟”等品种较易分化和再生，在所有处理组合中都有一定程度的分化和再生几率。而品种 “盛宴”、“布鲁克”等则只在特定条件下分化和再生，二者在7种处理组合中分别只有2种和1种处理下能够分化和再生。显示出基因型在植株再生中的重要性，类似的结轮在水稻品种组培体系中也有发现(郭蕾等, 2006)。

影响组织培养再生体系的最重要因素是激素的种类、浓度和配比，主要是细胞分裂素和生长素。6-BA是一类人工合成的细胞分列素，具有促进细胞分裂、组织分化、芽体生成等作用，因其高效、稳定、廉价等特点，在组培研究中被广泛采用。2,4-D是植物组培过程中常用的生长素，稳定性高、耐热性强，具有较强的组培启动能力，有促进细胞生长、分裂、生根的作用。与细胞分裂素横向扩大增粗细胞不同，生长素促进细胞纵向伸长以增大细胞体积。因此，两者合适的比例会有助于愈伤组织细胞的分化和植株再生。本研究发现，2 mg/L 6-BA对大多数草地早熟禾的愈伤组织的分化促进效果最佳；在2 mg/L 6-BA上添加少量2,4-D对部分品种的草地早熟禾愈伤组织分化亦有促进作用，如“帝王”与“蓝鸟”在添加0.2 mg/L 2,4-D使分化率分别提高了20%和23.3%；反之，在0.1 mg/L 2,4-D上添加6-BA时，6-BA浓度越高，品种分化的几率越大，如“蓝鸟”在添加2 mg/L 6-BA后，分化率比添加0.1 mg/L和1 mg/L的6-BA分别提高了4倍左右。从另外一个角度分析，不同的品种对激素的敏感性存在很大不同，如“克尼尔沃特”对2,4-D比较敏感，“蓝鸟”需要一定浓度的6-BA (2 mg/L)，“超级伊克利”需要一定的6-BA/2,4-D比例(20 X)，而“帝王”需要较高浓度的6-BA和2,4-D，“布鲁克”只能在特定6-BA和2,4-D浓度下(2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D)才能分化和再生。这一现象在另外一些早地早熟禾品种的研究中也得到了验证(高丽美, 2007; 马忠华等, 1999; 麻冬梅等, 2008; Valk et al., 1995)，并且，在苎麻、玉米、水稻的愈伤组织分化研究中也有类似的报道(王晓玲和彭定祥, 2005; 夏燕莉, 2002; 郭蕾等, 2006)。

除了激素的影响作用，草地早熟禾的愈伤组织分化和再生也受其它因素的影响，如陈智勇等(2007)利用三种培养基MS、CC、NB研究了“优异”、“巴林”、“肯塔基”的分化再生，发现在三种培养基上的平均分化率分别为22.61%、35.22%和79.31%。因此，在建立草地早熟禾再生体系时，要综合考虑各种因素的影响，最大限度地挖掘最适条件，以提高愈伤组织细胞分化和植株再生的几率，促进草坪草品种改良的基因工程研究。

3材料与方法
3.1试验材料
选取生产上常用的6个草地早熟禾品种：帝王(Diva)、盛宴(Feast brand)、超级伊克利(Total Eclipse)、布鲁克(Brook lawn)、克尼尔沃特(Clearwater)、蓝鸟(Bluebird)，以成熟种子(购自中种公司)作为外植体诱导愈伤组织。

3.2愈伤组织分化优化实验
选取较为干燥、致密、淡黄色、大小均匀一致且生长状态良好的愈伤组织细胞，放置于分化培养基上进行分化和再生研究。分化培养基设置7种处理组合，分别由MS培养基与不同激素组合而成(表2)。每个培养皿接10块愈伤组织，每3周继代一次。观察愈伤组织的分化情况，记录分化的绿芽数，计算每一处理组合下品种愈伤组织的分化率(愈伤组织分化率=分化的愈伤组织总数/愈伤组织接种总数×100%)。
 

 
分化出的小芽长到2~3 cm长度时，将小芽转移到生根培养基中，生根培养基为1/2MS+与愈伤组织分化同等浓度配比的激素处理。

作者贡献
雷炳琪、代亮是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成论文初稿的写作；柳玉霞、刘洁完成数据分析；徐筱、徐倩参与实验设计，试验结果分析；徐吉臣是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(J1103516, 31128016)及北京市自然科学基金项目(5112015)共同资助。

参考文献
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