cDNA文库是指包含某种生物的某一特定发育时期内所转录的全部mRNA信息的cDNA克隆集合。cDNA文库在植物的遗传和功能研究中具有重要的应用价值，可以用于筛选构建分子连锁图谱的探针，分离重要基因，分析基因表达信息等，是新基因发现和功能基因组学研究的基础(蔡宁波等, 2007)。对于近期不能开展全基因测序的物种而言，全长cDNA文库更是寻找和筛选目标基因的重要手段之一。在已经克隆的众多基因中，有许多都是通过筛选cDNA文库获得的(晏慧君等, 2006; 王晨等, 2010)。近年来，众多学者已经构建了许多模式生物和重要农作物的cDNA文库，通过大规模的EST测序，获得了海量的数据，促进了相关植物功能基因组学研究的发展(Kikuchi et al., 2003; Kim et al., 2006; Seki et al., 1998; Carninci et al., 2003)。

黄麻是椴树科黄麻属中的一种草本植物，是一种极其重要的纤维作物，在麻纺和造纸工业中被广泛应用。黄麻在我国的栽培历史悠久，产量丰富，是21世纪极具开发潜力的作物之一(彭文芳, 2007)。目前，黄麻的遗传研究主要集中在分类进化、种质资源，质量性状和数量性状等传统生物学角度上，从分子水平上来研究黄麻的报道并不多见。总体而言，黄麻的遗传研究基础相当薄弱，迄今为止，黄麻尚未见完整的分子遗传图谱，短期内也未能开展全基因组测序工作。

本研究首次构建了黄麻全长cDNA文库，该文库将为进一步开展黄麻EST大规模测序、功能基因组学研究及克隆优良性状的基因等奠定基础；同时，还可以从文库中筛选构建分子连锁图谱的探针，这对于遗传研究基础薄弱的黄麻而言，是一种快速而高效的策略。

1结果分析
1.1黄麻总RNA提取
高质量的RNA是cDNA文库构建的必要前提，因此黄麻总RNA的提取质量至关重要。由RNA 的凝胶电泳结果(图1)可以看出：黄麻闽引一号总RNA中含有18S和28S两条清晰的带，且28S:18S约为2:1，表明本研究所提取的黄麻总RNA完全符合构建文库的标准

 
1.2 cDNA合成
本研究采用LD-PCR扩增方法合成ds cDNA。该方法在起始RNA大于50 ng就可以合成ds cDNA，对起始模版量的要求极低。根据所提取的黄麻总RNA含量(约400 ng)，最终确定进行20个循环的扩增，从而获得黄麻cDNA的第二链。电泳检测结果表明(图2)：扩增效果良好，cDNA大多弥散分布于0.3~5 kb之间，其中，在1.0~2.5 kb之间的条带最亮，说明这个区域的cDNA分布最密集，该结果表明合成的ds cDNA符合建库的要求

 
1.3 cDNA的分级
单滴收集分级分离的dscDNA，分别编号为1~ 17，凝胶电泳检测结果(图3)。由图3可以看出：管号8、9、10和11的条带信号最强。为了构建高质量的文库，避免回收300 bp以下的小片段，本研究只收集7、8、9和10四管的dscDNA，共收集120 μL。纯化后用于下一步的连接反应。
 

 1.4 cDNA文库滴度和插入片段大小鉴定
通过倍比稀释计数法鉴定文库滴度，测定结果为1.9×10⁶ pfu/mL，可见所建的cDNA文库的滴度达到了预期的要求。重组子插入片段的大小检测结果表明(图4)：所建文库插入片段的大小大多居于0.5~ 2 kb之间，比酶切产物的密集区(1.0~2.5 kb)略小，该结果可能是由于载体优先与片段较小的cDNA连接的缘故。然而，对于EST测序或探针筛选而言，这个长度范围是适合的。

 
2讨论
在众多的cDNA文库构建方法中，本研究所使用的SMART技术是一种较好的cDNA文库构建技术，该方法利用逆转录酶PowerscriptTMRT的逆转录和末端转移活性及内切酶SfiⅠ的特性，可以在原始材料较少的情况下(仅需50 ng的总RNA)，快速、高效地构建各种生物材料的全长cDNA文库。该方法能够大幅提高具有完整的5'末端克隆子在文库中的比率，克服了其它许多构建文库的方法中不能完整地合成完整mRNA的缺点，被广泛接受和使用。然而，欲将该技术应用于黄麻cDNA文库的构建，还有几个关键的细节必须把握。首先，在利用酚/氯仿进行抽提和乙醇沉淀的过程中，由于cDNA量少，为了避免ds cDNA损失过多，研究者通常会尽可能多地吸回水相，这种操作习惯通常使酚有痕量残留，严重抑制随后SfiⅠ的消化。所以，应避免过多地吸回水相。在这个操作过程中，胶回收是较好的纯化方式。其次，为了获得插入片段较大的高质量文库，cDNA酶切后分级分离产物的收集至关重要。如图3中的第11号管，虽然大多数片段长度能达到预期的要求，但是，由于其中可能含有小于300 bp的片段，从而影响文库的质量，故在操作中将其舍弃。

构建高质量的cDNA文库是开展功能基因组学研究及克隆优良性状基因的前提。库容量和插入片段大小是衡量cDNA文库质量的两个重要指标。在真核生物中，要从一个cDNA文库筛选低丰度的mRNA，一般要求文库滴度达到5×10⁵ pfu/mL (刘铜等, 2010)，本研究所构建的文库滴度达1.9×10⁶ pfu/mL，具较高的覆盖度。在文库插入片段大小方面，一般而言，插入片段越大，代表文库所包含的信息越完整。本研究的插入片段在0.5~2 kb之间，暗示我们所构建的文库具有一定复杂性和完整性。

本研究利用CLONTECH公司提供的SMART方法，首次构建了高效的黄麻cDNA文库，经滴度测定、插入片段的PCR鉴定等均符合cDNA文库的质量要求，本研究为构建分子标记连锁图谱的探针筛选和进一步开展黄麻的EST测序分析、目的基因克隆及功能基因组学研究奠定了基础。

3材料与方法
3.1供试材料
植物材料为黄麻(Corchorus olitorius L.)品种闽引一号的种子，由福建农林大学祁建民教授提供。

3.2黄麻总RNA提取
将湿滤纸置于培养皿上，取少量黄麻闽引一号种子均匀撒于其上，在25℃左右萌发并生长8 d左右。本研究按Qiagen Plant RNeasy Kit (QIAGEN)试剂盒提供的方法提取黄麻幼苗总RNA，材料用量为180 mg左右。由于黄麻的RNA产量较少，本研究连续重复使用QIAGEN的柱子两次，然后合并两管，用紫外分光光度计测定RNA样品的浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和相对浓度。

3.3黄麻cDNA文库的构建
参照SMART Ⅲ操作手册，取1 μg的黄麻总RNA 逆转录成cDNA的第一条链(sscDNA)。取2 μL第一链的cDNA为模板，经LD-PCR扩增合成黄麻的ds cDNA。扩增的程序为：95℃ 1 min；(95℃ 5 s; 68℃5 min) ×20 cycle。在1%凝胶上电泳检测结果。将经过蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后的黄麻ds cDNA，用试剂盒提供的CHROMA SPIN-400柱对黄麻ds cDNA的酶切产物进行分级分离(单滴收集)，电泳检测并回收大于0.5 kb的部分，使用乙醇作进一步沉淀和干燥处理后，溶于7 μL SDW中备用。取1 μL cDNA与λTriplEx2载体置于16℃下连接反应过夜。连接产物使用Promega公司提供的Packagene Lambda DNA Packaging System进行包装，然后加入500 μL SM buffer和20 μL氯仿至包装结束后的产物中，混匀并离心，沉淀细胞破碎物。在试管的上清中已含有phage，即为初级文库。为了后续研究方便，在初级文库中加氯仿和DMSO后分装，每管为5 μL，置于-70℃中保存。

3.4 黄麻cDNA文库滴度与插入片段大小的测定
本研究采用倍比稀释计数法来鉴定文库滴度，取5 μL初级文库经1×λ稀释Buffer稀释(10倍, 100倍和1 000倍)后；各取10 μL菌液用于文库滴度测定。按照试剂盒说明书的方法，将经过鉴定的λTriplEx2阳性克隆转化成pTriplEx2质粒克隆(宿主菌为E.coli BM25.8菌株)。文库插入片段大小的鉴定采用5'和3'测序引物对克隆进行PCR扩增的方法进行。分别挑取86个克隆于86个(含5 μL H₂O) 1.5 mL Epp-endorf管中，于沸水中煮5 min后作为PCR扩增的模板，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

作者贡献
吴为人和谢小芳是本研究的实验设计和实验研究的执行人；吴为人是项目的构思和负责人，指导实验设计和论文修改；谢小芳是实验研究的执行人，完成试验和结果分析及论文写作工作；陈燕萍参与实验材料的准备及文献收集和整理工作；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由福建省自然科学基金项目(2012J01076)资助，在此表示感谢。

参考文献
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