金花茶(Camellia nitidissima Chi)是山茶科(Theaceae)山茶属金花茶组植物，为常绿灌木或小乔木。作为国家一级保护植物和稀有物种金花茶已列入中国植物红皮书(傅立国, 1992)和《国际生物多样性公约》附属Ⅱ物种(黄付平, 2001)。金花茶花蜡质金黄、金瓣玉蕊，它含有特殊的黄色遗传基因KNA在植物界十分罕见,填补了园艺学家梦寐以求的黄色系列茶花的空白(秦小明等, 2005)。因此金花茶是世界珍稀的观赏植物和种质资源,被人们誉为“茶族皇后”和植物界的“大熊猫”。

邓桂英等(2000)对金花茶的杂交育种、染色体数目及核型分析、分类及其演化、孢粉学以及应用研究等方面的最新进展作了总结概述。但是金花茶的分子生物学研究相对滞后，目前已报道的应用于金花茶的分子标记主要有RAPD(施苏华等, 1998; 唐绍清等, 1998), ISSR(宾晓芸等, 2005) 和AFLP(宾晓芸, 2005)。

相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)分子标记是一种基于PCR的新型标记,具有简便、快捷、稳定、高效、共显性高及在基因组中分布均匀等特点(Li et al., 2001)。该分子标记的引物设计简单，上、下游引物分别对外显子区域及内含子和启动子区域进行特异扩增，根据不同个体和物种的内含子、启动子及间隔区长度的不同而产生多态性，并且17 bp的正向引物、18 bp的反向引物以及50℃的退火温度保证了扩增结果的稳定性。迄今为止，SRAP标记在观赏植物研究中的应用甚少，仅在石斛(樊洪泓等, 2006)、石蒜(袁菊红等, 2007)、百合(陈琼等, 2007)、牡丹(Han et al., 2008; Hao et al., 2008)、桂花(李梅等, 2009)和菊花(张飞等, 2009; Zhang et al., 2010)中有相关报道，在金花茶研究中尚未见报道。

由于不同的植物的SRAP最佳反应体系差别很大(刘立军等, 2006)，甚至同一种植物在不同的试验条件下其研究结果都有差异(柴丹丹等, 2008)。因此，本研究以观赏植物金花茶基因组DNA为模板,探讨SRAP-PCR反应体系中5种因素对扩增的影响，以期获得金花茶SRAP扩增的最佳反应体系，为进一步利用SRAP标记技术开展金花茶种质资源遗传多样性研究、连锁遗传图谱构建和分子标记育种等方面将发挥重要作用。

1结果与分析
1.1金花茶茶基因组DNA的SRAP-PCR反应体系的正交实验
参照穆立蔷等(2006)的方法，对金花茶基因组DNA的SRAP-PCR反应体系中Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA用量等5个因素4个水平组合的正交实验结果进行统计分析，结果见表1。由表1中的R值可以看出，对金花茶基因组DNA的SRAP-PCR扩增反应结果的影响由大到小依次为：Mg²⁺浓度、模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、dNTPs浓度。从k值来看，Mg²⁺浓度为1.50 mmol/L、dNTPs浓度为0.25 μmol/L、引物浓度为0.30 μmol/L、 Taq DNA聚合酶用量为1.0 U、模板DNA用量以100 ng时，扩增结果最好。

表1金花茶基因组DNA的SRAP-PCR反应的正交实验设计及结果 Table 1 The design and result of orthogonal experiment of SRAP-PCR reaction system of genomic DNA from Camellia nitidissima

根据正交实验结果，初步确立金花茶基因组DNA的SRAP-PCR反应的适宜反应体系应含1.50 mmol/L Mg²⁺、0.25 μmol/L  dNTPs、0.30 μmol/L引物、100 ng模板DNA及1. 00 U Taq DNA聚合酶。

采用不同的反应体系，金花茶基因组DNA的SRAP-PCR扩增电泳图谱见图1。由图1可以看出，采用dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量以及模板DNA用量不同的16个反应体系，扩增结果存在差异。第5、6、7、8、9、10、11、13和14号反应体系的扩增效果较差，条带弱而且多态性较低，有弥散和拖尾现象；第1、2、4、12和15号反应体系的扩增条带虽然丰富，但是条带较弱；第3和16号反应体系的扩增结果不仅多态性好，且条带较清晰。综合比较条带强弱及多态性，初步选定将第3号反应体系(含1.50 mmol/L Mg²⁺、0.20 μmol/L dNTPs、0.40 μmol/L引物、75 ng模板DNA及1.50 U Taq DNA聚合酶)作为金花茶基因组DNA的SRAP-PCR反应体系。

图1 不同反应体系中金花茶基因组DNA的SRAP-PCR扩增图谱(引物组合Me2-Em10) Figure 1 SRAP-PCR amplification pattern of genomic DNA from Camellia nitidissima in different reaction systems (primer combination Me2-Em10) 注: M: 100 bp Plus DNA Ladder; 1-16: 反应体系编号 Note: M: 100 bp Plus DNA Ladder; 1-16: No of amplification systems

1.2 金花茶SRAP-PCR反应体系的确立
对表1的统计分析结果及图1的直观分析结果进行综合分析，结果显示，根据正交实验结果筛选出的金花茶基因组DNA的SRAP-PCR适宜反应体系与根据扩增图谱筛选出的第3号反应体系存在差异。综合考虑实验成本及扩增效果，最终确定金花茶基因组DNA的SRAP-PCR的最佳反应体系为：反应体系总体积20 μL，含1.50 mmol/L Mg²⁺、0.20 μmol/L dNTPs、0.30 μmol/L引物、75 ng模板DNA、1.00 U Taq DNA聚合酶及1×PCR Buffer。

1.3金花茶SRAP-PCR反应体系的稳定性分析
应用上述最佳反应体系，随机选择SRAP引物组合Me5-Em3，对随机选择的金花茶10个单株进行SRAP-PCR扩增，结果见图2。由图2可以看出，引物组合对每份DNA样品均能扩增出多态性丰富、条带清晰的DNA片段，说明该SRAP-PCR反应体系稳定可靠，适用于金花茶基因组DNA的SRAP-PCR扩增反应。

图2 金花茶基因组DNA的SRAP-PCR扩增图谱 Figure 2 SRAP-PCR amplification pattern of genomic DNA from Camellia nitidissima 注: M: 100 bp Plus DNA Ladder; 1-10: 10个金花茶单株编号 Note: M: 100 bp Plus DNA Ladder; 1-10: No of 10 individuals of Camellia nitidissima

2讨论
SRAP-PCR反应受反应条件和扩增程序变化等因素影响，此外，不同物种对反应条件的要求也存在一定的差异。因此，对金花茶基因组DNA的SRAP-PCR反应条件进行优化是非常必要的。正交实验设计可以考察各因素之间的相互效应，具有均衡分散、综合可比、伸缩灵活及效应明确的特点，能迅速获得满意的试验结果，而且试验规模小，节省人力物力。所以利用正交实验设计对影响SRAP-PCR反应的主要因素进行筛选，能较快地寻找到合适的反应参数,避免单因素实验结果的不足。但在个别因素用量方面也存在一定差别，可能由于正交设计中主要根据电泳条带的清晰度及条带数目判断依据带有一定的主观成分所致(邹小云, 2010)。

袁菊红等(2007)的研究结果表明，Mg²⁺浓度对石蒜SRAP扩增结果的影响最明显，但dNTPs浓度对扩增结果影响不明显；本研究结果和郭大龙等(2006)的研究结果一致，而与张飞等(2009)和王艳青(2009)的研究结果存在差异，这可能与研究物种的不同有一定的关系。在不同物种的SRAP-PCR反应体系中，既有相似的影响因素，也有各自特殊的反应条件,因此,应针对不同的研究对象设计不同的SRAP-PCR反应体系。本研究从经济有效的角度，在对扩增图谱进行直观分析和对条带数目进行统计分析的基础上，对最优反应体系参数做了适当的调整，确定了金花茶基因组DNA的SRAP-PCR的最佳反应体系为：反应体系总体积20 μL，含1.50 mmol/L Mg²⁺、0.20 μmol/L dNTPs、0.30 μmol/L引物、75 ng模板DNA、1.00 U Taq DNA聚合酶及1×PCR Buffer。

对该体系的验证结果证明, 本研究建立的金花茶SRAP-PCR反应体系稳定、可靠, 这一优化的反应体系为进一步利用SRAP分子标记技术对金花茶的资源鉴定、分类和分子遗传图谱的构建及基因定位奠定了良好的试验基础。

3材料与方法
3.1供试材料与试剂
供试材料为金花茶，2010年采自上海植物园山茶资源圃。

用于SRAP 反应的引物等试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，经初步筛选，确定Me2 (TGAGTCCAAACCGGAGC)和Em10 (GACTGCTACGAATTCAG)作为此次正交试验的固定引物。

3.2金花茶基因组DNA模板的提取与检测
取金花茶嫩叶采用CTAB微量法提取基因DNA，将基因组DNA和Lambda DNA用质量体积分数1.0% 琼脂糖凝胶电泳，以检测基因组DNA的纯度和浓度,并用双蒸水稀释至100 ng/μL， -20℃保存备用。

3.3 SRAP-PCR反应体系的正交实验设计
以金花茶的嫩叶为材料，采用正交设计L₁₆(4⁵)进行试验，PCR反应各因素水平见表2。对Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA酶用量、引物浓度和模板DNA用量进行5因素4水平正交实验，3次重复。
 

表2 PCR反应的因素水平 Table 2 Factors and levers of PCR reaction

 
3.4 SRAP-PCR扩增及检测
扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性40s，37℃复性50 s，72℃延伸1.5 min，8个循环反应； 94℃变性40 s，50℃复性50 s，72℃延伸1.5 min，32个循环反应；72℃延伸10 min。扩增反应结束后，分别加入0.5 μL 6×溴酚蓝，离心混匀后,取7 μL扩增产物用质量体积分数2.0%的琼脂糖凝胶电泳,凝胶中含0.05% 的溴化乙锭(EB)。电极缓冲液为1×TAE，电泳电压5V/cm，电泳时间45 min，电泳结束后,在凝胶成像分析仪上观测并拍照。

3.5 SRAP-PCR反应体系稳定性的检测
随机选取金花茶10个个体植株的基因组DNA作为模板，选用引物组合Me5-Em3，按照上述SRAP-PCR扩增及检测方法,对优化确定的金花茶基因组DNA的SRAP-PCR反应体系的稳定性进行检测。
 
作者贡献
李健、蒋昌华和 张亚利是本研究的实验设计和实验研究的执行人；李健和蒋昌华完成数据分析，论文初稿的写作；刘炤和赵晓峰参与实验设计，试验结果分析；胡永红是项目负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由上海市科技兴农重点攻关项目(2008D10-4号)资助。作者感谢浙江农业科学研究院萧山花卉研究所张飞博士在本实验过程中的实验建议和修改建议。

参考文献
Bin X.Y., Tang S.Q., Zhou J.Y., Song H.T., and Li Z.Y., 2005, ISSR analysis on genetic diversity of Camellia nitidissima Chi (Theaceae) in China, Wuhan Zhiwuxue Yanjiu (Journal of Wuhan Botanical Research ), 23 (1):20-26 (宾晓芸, 唐绍清, 周俊亚, 宋洪涛, 黎尊谊, 2005, 金花茶遗传多样性的ISSR分析, 武汉植物学研究, 23(1): 20-26)

Bin X.Y., 2005, Genetic diversity and population structure of Camellia nitidissima as revealed by ISSR, RAPD and AFLP markers, Thesis for M.S., Guangxi Normal University, Supervisor: Tang S.Q., pp.31-34 (宾晓芸, 2005,金花茶遗传多样性和居群遗传结构的ISSR, RAPD和AFLP分析, 硕士学位论文, 广西师范大学,导师：唐绍清, pp.31-34)