茎瘤芥(Brassica juncea var tumida Tsen et Lee)作为传统加工蔬菜，产量高，质量好，市场竞争力强，成为中国重要的特色农产品。甬榨系列是由宁波市农科院自主选育的榨菜新品种，包括‘甬榨1号’(王毓洪等, 2009) (采收期早, 适合水稻冬闲田种植)、‘甬榨2号’(孟秋峰等, 2010) (生长势强, 产量高)和‘甬榨3号’(杂交种, 抗病性强)等。在新品种的推广种植过程中，准确快速地鉴定品种真实性，是确保育种者和种植者利益的重要手段。鉴定榨菜品种真实性的常规方法主要是利用苗期或成株期形态学指标进行，周期长且准确性差，特别是鉴定表型相似的榨菜材料，形态指标难以奏效(汪炳良, 2006, 中国三峡出版社, pp.6-7)。近年来，以DNA为基础的分子标记技术迅速发展，通过该技术构建作物品种DNA指纹图谱，能够快速准确地鉴定品种，为作物育种和种子管理提供了极大的便利(马琳等, 2010)。目前该技术已广泛应用于水稻(从夕汉等, 2010)、白菜(王笑一等, 2008)和甜瓜(王美荣等, 2010)等作物，有关榨菜品种指纹图谱构建与利用的研究未见报道。为此，本研究拟利用SSR分子标记，构建‘甬榨1号’、‘甬榨2号’和‘甬榨3号’指纹图谱，为保护育种者知识产权提供新途径。

1结果与分析
1.1SSR多态性引物的筛选与供试榨菜材料的多态性分析
在90对SSR中，共筛选到6对SSR引物S8005/8006、S8021/8022、S8051/8052、S8071/8072、S8125/8126和S8159/8160，在5份榨菜材料中稳定扩增出6个差异位点，揭示供试材料的多态性比例为6.67% (图1)。

图1 SSR引物在‘甬榨1号’、‘甬榨2号’、‘甬榨3号’，及对照材料‘鲜榨1号’和‘余姚缩头种’中的扩增 Figure 1 SSR amplification of 'Yongzha No.1', 'Yongzha No.2', 'Yongzha No.3', ‘Xianzha No.1’ and ‘Yuyao suotouzhong’

1.2榨菜品种指纹图谱的构建
组合6个SSR多态性位点，构建供试榨菜品种的指纹图谱，结果见表1。其中‘甬榨1号’、‘甬榨2号’和‘甬榨3号’的指纹图谱分别是1-0-1-1-0-1、0-1-1-1-0-0和0-1-1-0-1-0，三个甬榨系列新品种可以通过各自指纹图谱进行区分，并与市售同类型对照‘鲜榨1号’(1-0-0-1-0-0)和‘余姚缩头种’(0-1-1-0-0-0)鉴别开。根据图谱出现概率公式计算结果，图谱出现概率为1/4851495000，出错概率十分微小，表明利用SSR技术构建指纹图谱鉴别和保护甬榨系列新品种是有效可行的。
 

表1 供试榨菜品种编号、名称和SSR指纹图谱 Table 1 Code, name, and SSR fingerprinting of mustard tuber varieties

2讨论
SSR分子标记多态性丰富，扩增稳定，是国际植物新品种保护联盟(UPOV)规定使用的分子标记类型之一(滕海涛等, 2009)。但是SSR标记具有种属特异性，开发成本高，目前有关榨菜SSR的开发利用报道较少。本研究参照文献报道，合成90对榨菜SSR引物，揭示供试材料的多态性比例为6.67%。这个多态性结果，远远低于付杰(2005)和陈发波(2010)利用相同SSR标记，分析29份中国芥菜和220份茎瘤芥种质遗传多样性时，获得的82.1%和85.0%的多态性研究结果。这主要是由于，本研究所选试材为仅凭外观不易区分的市售同类型榨菜品种，材料之间的相似程度高，多态性降低。付杰(2005)和陈发波(2010)研究中的供试材料多源于芥菜起源中心或近源植物，材料之间差异明显，多态性比例高。同样的，这也与水稻(从夕汉等, 2010)和甜瓜(王美荣等, 2010)等作物构建指纹图谱时，得到的低多态性比例(2.92%和3.28%)的结论是一致的。

甬榨系列是我院自主选育的榨菜新品种，本研究最终利用6对榨菜SSR引物组合，构建了供试榨菜品种特有的分子指纹图谱，能够逐一区分甬榨1号、甬榨2号和甬榨3号及其市售同类型对照品种‘鲜榨1号’和‘余姚缩头种’，图谱出现概率小，为榨菜新品种真实性检验提供了新方法。同时，随着榨菜品种日益丰富，品种间表型差异越来越小，不断筛选新的分子标记，以补充和扩展现有指纹图谱，是增强该技术鉴定和保护力度的重要措施。

3材料与方法
3.1榨菜材料
供试材料包括‘甬榨1号’、‘甬榨2号’和‘甬榨3号’，以市售同类型品种‘鲜榨1号’和‘余姚缩头种’作为对照。上述各材料外观相似，不易区分。

3.2试验方法
植株长至三叶一心时，10个单株混合采集嫩叶1 g，-80℃保存。利用CTAB法(Murray and Thompson, 1980)，提取新鲜叶片总基因组DNA。参照文献报道，合成90对榨菜SSR引物(陈发波, 2010; 付杰, 2005)。PCR反应体系为15 μL，包括1.25 mmol/L Dntp (3.24 µL)，10×buffer (1.5 μL)，25 mmol/L MgCl2 (2.43 μL)，5 mmol/L引物(1.35 μL)，10 ng/μL DNA (5 μL)，1 U Taq (0.05 μL)。PCR扩增程序为：预变性94℃(4 min)；变性93℃ (15 s)，退火37℃ (1 min 30 s)，延伸72℃ (2 min) (40个循环)；延伸72℃(6 min)。扩增产物在2.5%的MS-6高分辨率琼脂糖凝胶上电泳检测。

3.3数据分析
观察统计差异引物产生的等位位点数目和差异位点数目，通过公式2/n(n+1) (n表示等位基因的数目)，计算图谱出现概率。同时，对差异位点进行数字化处理，即“1”表示该差异位点有扩增，“0”表示该差异位点无扩增，构成供试材料指纹图谱。

作者贡献
宋慧、张香琴和孟秋峰是本研究的试验设计和实验研究的执行人；宋慧完成数据分析和论文实验设计和论文写作与修改；孟秋峰和王毓洪参与试验研究和结果分析。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家农业成果转化资金项目(2011GB2C220003)、国家自然基金(31000907)、宁波市国际合作项目(2010D10011)和宁波市农业重大攻关项目(2010C10012，2012C10034)共同资助。

参考文献
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