种间杂交是实现基因转移的重要途径，葡萄育种中人工杂交育种是最常规同时也是最有效的手段之一。由于葡萄闭花受精的习性以及人工去雄套袋不及时，杂交后代中可能存在部分的自交种或其它花粉的杂交种(贺普超, 1999; 孔庆山, 2004)。因此，对杂交后代的真实性进行鉴定，筛选出双亲杂交后代是进行目标品种选育和其他相关研究的基础和前提。对于植物杂交后代的鉴定，前人多采用植株形态学、细胞学、同工酶学等方法。形态学鉴定的周期较长，鉴定结果受环境变化影响较大；细胞学鉴定程序繁琐，技术水平要求较高，且分辨率不高，对于染色体短的和结构差异较小的个体难以准确鉴定(颜廷进和谭振新, 2004, 种子科技, 14(3): 153-155)；同工酶则由于酶种类限制不能反映全部的结构基因的信息，使分析产生一定的偏差，并且存在基因位点少，多态性水平低等缺点(曾明和杨柏云, 2006)。与上述方法相比，DNA分子标记技术具有很大的优越性：快速准确，多态性高，直接以DNA形式表现，不受外界环境、组织类别、发育时期等条件的影响，因此近年来在多种植物的杂种鉴定中得到广泛的应用(柳李旺和侯喜林, 2004)。张开春等(张开春和李荣琪, 1997)采用RAPD技术鉴定出了平邑甜茶×扎矮76的有性后代，马鸿翔等(马鸿翔和陈佩度, 2007)采用RAPD技术鉴定出东北草莓×凤梨草莓的种间杂交后代，鹿金颖等(2005)应用AFLP分子标记从冬枣自然授粉后代中鉴定出其中的冬枣×金丝小枣和冬枣×尖枣的杂交后代，王跃进等(1997)用RAPD标记鉴定了圆叶葡萄和真葡萄亚属间的远缘杂种。

相关序列多态性分析(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一种基于PCR的分子标记技术，由Li和Quiros(2001)提出，其基本原理是通过设计一对引物对ORFs (openreading frames, 开放阅读框)进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。SRAP技术具有简便、快速、稳定、多态性高，在基因组中分布均匀，不需预知物种的序列信息的特点。本研究采用SRAP技术对葡萄种间杂交组合‘红地球×双优’实生后代进行杂种的真实性检测，为今后杂种群体的进一步利用奠定基础。

1结果与分析
1.1基因组DNA的检测
对双亲及94份杂交后代共96份材料的DNA浓度和质量进行检测，经紫外分光光度计测定，所提取DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均介于1.7和1.9之间。琼脂糖检测结果表明，提取的DNA为一条清晰完整的带，与λDNA的位置基本相同，条带没有明显的拖尾，无蛋白质和RNA污染。说明本试验提取的DNA完整，纯度高，符合本试验的要求(图1)。
 

图1 葡萄部分杂交后代基因组DNA电泳 注: 图中1~3号样品为λDNA, 从左到右分别为100 ng, 150 ng, 200 ng; 4~17为杂交后代 Figure 1 Electrophoresis of genomic DNA for some progenies  Note: Number 1~3samp1es in the upper figure are λDNA, from left to right are 100 ng, 150 ng, 200 ng; Number 4~17 were cross progenies

1.2 SRAP引物组合的筛选
将80对引物组合在双亲中进行SRAP-PCR扩增，有20对引物组合扩增条带丰富、清晰并出现了父本特异性条带(图2)，这些引物都可以用于杂交后代的真实性鉴定。我们从中选取5对扩增条带较清晰容易分辨的引物，即引物组合Me1Em10-212, Me2Em4-87, Me2Em5-103, Me4Em6-175, Me8Em5-205用于‘红地球×双优’杂交后代的鉴定。
 

图2 部分引物组合筛选的扩增结果 注: M: DNA marker; 每对引物组合的试验材料左边为母本红地球, 右为父本双优 Figure 2 Amplified results with some primer combinations Note: M: DNA maker; The experimental materials were Red Globe grape and Shuangyou from left to right in each primer combinations

1.3红地球×双优后代杂种鉴定
本研究中应用的SRAP标记多为显性标记，符合孟德尔遗传规律。根据孟德尔的分离定律与自由组合定律，理论上如果使用杂合的显性标记鉴定有性杂交后代的真实性，应至少使用5个父本标记(如果引物可以获得多个父本标记，引物数量就少于5个)，因为每个杂合显性标记只能鉴定出有性杂交后代的50%为真杂种，鉴定概率为标记Ⅰ(50%)十标记Ⅱ(25%)+标记Ⅲ(12.5%)+标记Ⅳ(6.25%)+标记Ⅴ3.13%=96.9%，5个标记便可将F1代群体中96.9%的杂种鉴定出来(张开春和李荣琪, 1997)。本试验采用5对引物对两个亲本的杂交后代进行逐步鉴定，首先用Me8-Em5引物对所有杂交后代进行鉴定，共有41个后代具有父本特异带，初步确认为真杂种；然后用Me1-Em10引物对其余的53个后代再次鉴定，其中有33个单株中具有父本特异带；剩余的20株个体再用Me4-Em6引物进行鉴定，有7个具有父本特异带；用Me2-Em5引物对剩余的13个个体进行鉴定，有5个具有父本特异带。最后对以上无父本特异带的8个后代用Me2-Em4引物进行鉴定，8个后代有1个能扩增出父本特征带。对于以上引物鉴定过的7个未出现父本特异带的后代，用Me6Em7和Me6Em3引物进行鉴定，结果均未出现父本特征带。综合所有引物的鉴定结果，94个单株中确认87个株为双亲真杂种。

为验证结果的准确性，利用以上使用的5对引物分别对所有杂交后代进行重复鉴定，鉴定结果与之前结果完全一致。图3为Me8-Em5引物组合在‘红地球×双优’后代中的鉴定结果，经重复试验，结果可靠。对鉴定后的87株个体进行了田间形态学观察，在叶片、枝条特征等方面表现出明显的父本特征，表明这些单株为红地球×双优的种间杂种。
 

图3 引物组合Me8eM5对杂交后代的鉴定 注: 1~94为杂交后代群体; 表示父本特异带 Figure 3 Identification of crossing progenies by primer combination Me8Em5 Note: Number 1~94 were cross progenies;  Means Specific bands from male parent

2讨论
由于杂交育种工作的长期性，尤其在木本植物当中，育种周期可长达十几年，对杂交种后代的早期鉴定就显得尤为重要(钟淮钦等, 2005)。常规的杂种鉴定方法有形态学鉴定、细胞学鉴定、孢粉学鉴定和同工酶鉴定等，但由于材料本身的特点，及技术方法中存在的问题，使这些方法在实际的应用中受到很大的限制。与上述几种鉴定方法相比, DNA分子标记具有标记数量巨大，无器官、组织及发育特异性, 不受任何环境因素影响, 完全遵守简单的孟德尔式遗传且有体细胞稳定性等优点(郑成超和温孚江, 1997)。尤其是随着近年来分子标记技术和方法的飞速发展，已经成为植物杂种鉴定研究的有效工具。Li等(Li and Quiros, 2001)开发的SRAP分子标记技术，针对基因组中的ORF区域进行扩增，体现了物种间基因的多态性，检测结果更能体现出个体间真实的亲缘关系。

由于SRAP标记或为显性标记或为共显性标记，在双亲中进行引物筛选时无法判断具有父本特异带的位点的类型是纯和显性位点还是杂合显性位点。故需要结合3~5个SRAP标记进行综合分析。在后代中出现分离的父本特征带则可判断位点的基因型为Aa，全部后代显现父本特征带则为AA。如采用具有父本特征的纯和显性标记进行真假杂种鉴定，只需要通过一对引物就可以对所有杂交后代的真实性进行鉴定(乔燕春和林顺权, 2010)。本试验中鉴定‘红地球×双优’种间杂种时采用了5个父本特异标记，虽然这些标记均为杂合的显性标记，但是由于SRAP标记的谱带丰富、多态性高的特点，在杂种鉴定中很容易获得足够多的父本标记。

利用SRAP分子标记技术，对葡萄‘红地球×双优’种间杂交组合的94株实生苗进行了早期杂种鉴定。从80对SRAP引物中筛选出5对具有父本特征带的引物，共鉴定94株中的87株为真杂种。研究结果表明SRAP技术可有效的用于葡萄杂交后代的真实性鉴定及相关研究中。

3材料与方法
3.1试验材料
试验于2009年6月-2010年9月在沈阳农业大学果树分子生物学实验室进行。试验材料为欧亚种葡萄(Vitis vinifera)品种‘红地球’、山葡萄(Vitis amurensis)品种‘双优’及其种间杂交实生后代的94个单株，取自于沈阳农业大学葡萄资源圃。取幼嫩叶片于-80℃保存备用。

3.2试验方法
3.2.1基因组DNA的提取和检测  
DNA的提取采用Hanania(2004)的改良CTAB法。经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测浓度及质量后将样品浓度稀释至10 ng•μL^-1，并于-20℃保存。

3.2.2 SRAP-PCR扩增程序及扩增产物的检测  
SRAP-PCR扩增反应选用体系参照郭大龙等(2010)的研究方法并加以适当修改，20 μL体系包括模板DNA 10ng，Primer浓度为0.8 μmol• L^-1，dNTPs浓度为0.2mmol• L^-1，Mg²⁺浓度为3.2 mmol• L^-1，Taq DNA聚合酶为2.0 U。

SRAP-PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃最后延伸10 min，4℃保存。

扩增结束后，扩增产物于10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电泳结束后进行银染检测。

SRAP引物组合的筛选  选取8条正向引物和10条反向引物共组合80对SRAP引物组合，其序列见表1。对父母本材料进行多态性SRAP引物组合筛选，从中选出扩增条带较清晰、带型较丰富且出现父本特异性条带的引物组合，用于后代的真实性鉴定。

表1 SRAP引物序列 Table 1 Primer sequences used for SRAPA anylysis

作者贡献
郭修武和郭印山是本研究的试验设计人；张鹏翔和刘镇东是试验研究的执行人；张鹏翔，刘镇东，李坤完成数据分析，张鹏翔，刘镇东完成论文初稿的写作；李成祥参与试验设计，郭修武是项目的构思者及负责人，郭印山指导试验设计，数据分析及论文修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31000894)、国家现代农业产业技术体系建设专项基金项目(nycytx-30-ZP-08)、辽宁省科技厅重大科技攻关项目(200820403)、辽宁省教育厅科研项目(L2010492)和沈阳农业大学青年教师基金项目(20092005)共同资助。感谢沈阳农业大学郭修武教授与郭印山副研究员在本试验过程中的技术支持和有益建议以及刘镇东博士的大力协助。感谢课题组全体老师和同学的帮助。

参考文献
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