在水稻不育系繁殖群体中出现少量的自交结实株混杂，是不同类型水稻细胞质雄性不育系中普遍发生的问题。对此研究表明，保持系的混杂是繁殖不育系群体中出现的自交结实株的主要来源(陈玉虎, 1990, 浙江农业科学, (3): 125-127; 舒庆尧等, 1996; 张世辉等, 2002; 孙海波等, 2003; Yashitola et al., 2004)。其次，是不育系中存在外观性状上与保持系相似的能自交结实的正常可育株，混杂的这类可育株对不育系具有育性恢复能力(陆作楣等, 2000; 刘学军和孙林静, 1999)。

目前，对于各类型不育系中可育株核恢复基因来源的问题看法并不一致。有报道认为，可育株的恢复基因是由于不育系核不育基因存在遗传不稳定性而产生(周天理等, 1992)，或是由于保持系的微效恢复基因积累所产生(雷捷成等, 1984)。更多的研究认为，在野败型(陆作楣等, 2000)、红莲型(王际凤和陆作楣, 2007)和BT型(陈玉虎, 1990, 浙江农业科学, (3): 125-127; 刘学军等, 2004)不育系中出现的可育株恢复基因来自同类(籼稻/粳稻)杂交稻中的恢复基因的直接渗入和间接渗入。直接渗入是由于恢复基因Rf迁移到不育系直接产生可育株，其杂交和测交后代群体表现广泛的育性和性状分离；间接渗入是恢复基因先迁移到保持系，再传递到不育系产生可育株，这类可育株在外观性状上与不育系相似，难于识别。

在滇型杂交粳稻育种实践中，我们也发现育性稳定的用于配制组合的滇1型不育系中始终产生少量携带恢复基因的可育株，其在外观性状上与相应保持系一致，正常花粉率约为50%，细胞质仍表现雄性不育，细胞核拥有一个能使滇1型不育系育性恢复的恢复基因，位于水稻恢复基因Rf-1位点(文建成等, 2008; Wen et al., 2010)。但滇1型不育系中产生的可育株恢复基因的来源是否如他人研究报道一样，是由于粳型杂交稻或粳稻恢复系的恢复基因渗入到保持系，再迁移到不育系，在不育系群体中产生携带恢复基因的可育株，迄今没有得到证实。据此，本研究分析了不同年份不同地点用于繁殖滇1型不育系的父本保持系，以及繁殖不育系群体中出现的可育株恢复基因Rf-1位点，来探讨可育株的恢复基因是否因繁殖不育系的父本保持系孢子体携带核恢复基因迁移产生。这将为制定高纯度不育系繁殖技术措施提供参考依据。

1结果与分析
1.1不育系繁殖群体中可育株的田间鉴别
对2008年(蒙自)和2010年(昆明)种植的2个滇1型不育系黎榆A和榆密15A的繁殖群体的41 452株不育系的开花期花药进行检查，筛选到13株花药开裂散粉的植株，称之为“可育株”，其出现频率为0.031% (表1)。在外观形态上，这些可育株与其相应的不育系一致，但是有大约50%的正常花粉率，能自交结实，套袋结实率在73.8%~80.1%之间，各不育系群体中可育株单株间的结实率并无明显差异。

表1 滇1型不育系繁殖群体产生的可育株 Table 1 Fertile plants generated from multiplication population of rice CMS-D1 line

1.2可育株后代群体的结实率分析
用13株可育株给其相应不育系授粉，产生的13个BCF₁代群体的单株结实正常，各群体间套袋结实率平均在68.9%~81.2%之间，各群体中均未出现不育或低育株，各群体单株间结实率没有明显差异(表2)。此外，用这13株可育株给另外2个滇1型不育系滇系5号和合系42授粉所得的F₁代具有较高的结实率，单株结实率为40.1%~85.9%，各群体平均结实率在55.9%~75.6%之间，也没有出现不育或低育株(表2)。结果说明这些可育株对滇1型不育系具有育性恢复功能。

表2 可育株及其后代群体的套袋结实率 Table 2 Bagged seed-set rating of fertile plants and their progenies

在蒙自和昆明产生的这13株可育株自交S₁群体，次年在昆明种植结实也正常，群体间平均结实率在68.6%~83.2%之间，各群体单株间结实率也没有明显差异，任何S₁群体没有表现低育或不育现象(表2)。这表明这些可育株的育性不受种植环境影响。

1.3繁殖不育系亲本保持系及可育株的Rf-1位点鉴定
利用CAPS标记M49609BstUI分析了用于繁殖2个不育系的父本保持系孢子体的恢复基因位点，结果表明所有保持系都没有携带核恢复基因。在蒙自和昆明，用于繁殖不育系榆密15A的父本保持系榆密15B共计623株，都没有出现810 bp大小的与恢复系南34一致的恢复基因特有条带，而有两条611 bp 和199 bp大小的与不育系榆密15A一致的特有带(图1)。表明这些保持系没有携带育性恢复基因，它们的基因型与不育系(rf/rf)一致。同样，在用于繁殖不育系黎榆A的父本保持系黎榆B共计522株中，也没有发现任何一株携带恢复基因。

图1 用于繁殖不育系榆密15A的父本保持系的恢复基因位点基因型 Figure 1 Genotyping of the maintainer Yumi15B used to generate CMS line Yumi15A population

对2个不育系群体中产生的可育株恢复基因位点鉴定，结果表明所有可育株均携带核育性恢复基因。在蒙自繁殖并种植的2个不育系黎榆A和榆密15A群体中出现9株可育株(L0801, L0802, Y0801, Y0802, Y0803, Y0804, Y0805, Y0806和Y0807)，不仅具有一条约810 bp的恢复基因特征带，而且具有两条大约611 bp和199 bp的不育系特征带(图2)。说明这些可育株都有一个核恢复基因，且为杂合基因型(Rf/rf)。同样，对在昆明繁殖并种植的2个不育系群体中发现的4株可育株(L1001, L1002, Y1001和Y1002)的恢复基因位点分析，也证实可育株都携带一个核恢复基因。

图2 在蒙自繁殖的不育系黎榆A和榆密15A群体中出现的可育株的恢复基因位点基因型 Figure 2 Genotyping of the fertile plants in CMS line LiyuA and Yumi15A populations generated at Mengzi

2讨论
利用恢复基因共显性CAPS标记M49609BstUI，分析了不同年份(2007年和2009年)繁殖不育系的父本保持系恢复基因Rf-1位点的基因型，发现繁殖不育系黎榆A和榆密15A所用的1 145株父本黎榆B和榆密15B的孢子体基因型都表现为rfrf，没有出现保持系单株携带育性恢复基因Rf。但在每年繁殖的各个不育系群体中均产生少量携带恢复基因的可育株，其基因型为杂合基因型Rfrf，该恢复基因能使滇1型不育系的育性恢复。这说明滇1型不育系繁殖群体中出现的可育株携带的核恢复基因不是来自不育系繁殖父本保持系的孢子体。这一结论与我们对滇1型不育系合系42A群体中出现的可育株携带的恢复基因来源不可能是父本保持系合系42B的推断吻合(文建成等, 2008)。但有研究报道，水稻不育系群体中出现的可育株恢复基因，是由于用于繁殖不育系的父本保持系中存在携带恢复基因的植株，在繁殖时恢复基因迁移至不育系所致(刘学军和孙林静, 1999; 陆作楣等, 2000; 王际凤和陆作楣, 2007)。

对可育株的自交和测交后代分析，群体单株的结实率和外观性状上均没有出现明显分离，没有观察到被异品种花粉污染的情况。说明滇1型不育系中可育株的恢复基因不是来自粳型杂交稻的恢复基因直接迁移所致。有研究报道认为，粳型杂交稻恢复基因直接迁移是粳型不育系群体产生携带恢复基因的可育株的一个重要途径，在可育株的自交和测交后代群体中能观察到明显性状分离(陆作楣等, 2000)。至于滇1型不育系中可育株携带的恢复基因来源途径有待进一步研究。

3材料与方法
3.1试验材料
试验材料为用于杂交种子生产的育性稳定的滇1型粳稻不育系黎榆A和榆密15A及其相应的保持系黎榆B和榆密15B，在2个不育系繁殖群体中产生的13株携带恢复基因的可育株，以及这些可育株自交S₁和给不育系授粉杂交F₁代群体。

3.2试验种植
材料种植于蒙自和昆明，其中蒙自(海拔为1 260 m, 年均温18.6℃)于2月下旬播种，4月上旬移栽，6月抽穗，7月收获。昆明(海拔1 890 m, 年均温15.7℃)于3月中旬播种，5月初移栽，7-8月抽穗，10月收获。采用单苗栽插，灌溉和施肥管理与当地水稻生产一致。

3.3方法
3.3.1繁殖不育系群体及可育株的鉴定
不育系繁殖群体在蒙自和昆明产生。于2007年在蒙自种植2个不育系，黎榆A和榆密15A及其相应保持系黎榆B和榆密15B，在开花期将不育系植株上开放过的颖花剪去后，对不育系的稻穗进行剪颖处理，并用相应的保持系与之套袋授粉，不育系与保持系杂交便获得新一代不育系种子。于2009年在昆明种植这2个不育系及其保持系，采用相同的繁殖方法，繁殖2个不育系群体。

把蒙自和昆明繁殖的2个不育系种子分别在2008年和2010年种植，在开花期对繁殖不育系群体进行检查，出现花药开裂散粉而外观性状与保持系相似的单株，视为可育株。将可育株上正开放和已开过的颖花剪去，并进行套袋处理，即可获得自交后代S₁。同时，用可育株给相应的不育系授粉，可获得回交F₁代，又给另外2个滇1型不育系(滇系5号A和合系42A)授粉杂交获得F₁代。次年(2009年和2011年)在昆明种植自交S₁、测交BCF₁代和杂交F₁代。

3.3.2检测花粉的育性及结实率
检测各个可育株的套袋结实率和花粉育性，以及各个S₁、BCF₁和F₁群体的套袋结实率。花粉育性鉴定和结实率分析方法同文建成等(2008)。

3.3.3恢复基因位点的分子标记分析
采用CTAB法(Murry and Thompson, 1980)，分别提取在蒙自和昆明用于繁殖2个不育系群体的父本保持系单株的叶片总DNA，以及在不育系繁殖群体中产生的可育株的叶片DNA。利用与水稻Rf-1恢复基因连锁的共显性CAPS标记M49609BstUI进行基因型分析，标记系列根据Komori等(2004)的报道。PCR反应程序同文建成等(2008)。

作者贡献
张江丽和文建成是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张江丽完成数据分析，论文初稿的写作；李娟、孙朝华、谭亚玲参与实验结果分析；黄大军、普世皇、金寿林参与大田试验；谭学林和陈丽娟参与项目的构思和实验设计；文建成是项目的负责人，指导实验设计，数据统计，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究得到了云南省教育厅重点基金项目(2011Z039)、国家自然科学基金项目(31060088)和云南省科技计划项目(2009BB007)的共同资助。

参考文献
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