研究背景
丝瓜为葫芦科(Cucurbitaceae)丝瓜属中的栽培种，有普通丝瓜(Luffa cylindrical (L.) M.J. Roem)和有棱丝瓜(Luffa acutangula (L.) Roxb.)两种类型(中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 2010, 中国农业出版社, pp.683-686；罗少波等, 2006, 广东农业科学, (1): 15-17)，丝瓜在我们南北地区均有栽培，尤以广东、广西、台湾等地区和长江流域地区栽培为盛。有棱丝瓜是我省主栽瓜类作物，对于调节蔬菜秋淡季蔬菜供应有极重要的作用，丝瓜不但营养丰富，还具有生津止渴，解暑消烦之功效(邵兴云, 2004, 生物学通报, 39(5): 9-10)，夏秋季市场需求巨大。丝瓜资源丰富，类型多样，从果皮色可分为深绿色、绿色和绿白色等，棱沟有无棱沟，浅棱沟和深棱沟；果型有长棍棒形、棍棒形、短棍棒形；长圆柱形、圆柱形等。从表型可见丝瓜遗传多样性丰富，目前有关丝瓜分子标记的报道也有一些(夏军辉和向长萍, 2008; 苏小俊等, 2010; 崔竣杰等, 2012)，但相关研究结果获得评价有所差异。为了进一步证实本研究材料中丝瓜的遗传关系，我们利用SRAP分子标记对对31份丝瓜开展了遗传多样性分析，SRAP (sequence-related amplified polymorphism, 相关序列扩增多态性)是2004年由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros 博士研究芸薹属作物时创立的一种分子标记技术，它具有操作简便、高的共显性、重复性好、易于分离条带及测序等优点，被很多研究者用在种质资源的遗传关系、分子遗传图谱等的研究。本研究通过从基因层面对丝瓜材料进行评价，可为丝瓜种质的收集、保存、鉴定、创新、利用以及杂交育种中的亲本选择、选配提供可靠依据。

1结果与分析
1.1 DNA提取
高质量的DNA是保证实验质量的重要环节，本研究采用快速磨样机磨样，快速便捷的提取了高质量的DNA，完全可以满足本实验的要求(李莲芳等, 2011)。

1.2 SRAP技术分析
本研究通过正反向引物配对，组成99组SRAP引物组合，从中筛选出20个多态性较好的组合对31份丝瓜材料进行分析，获得了稳定的310条遗传条带，图1为引物em7me7在4%聚丙烯酰胺扩增的图样。从电泳图的统计结果来看，共计280条差异带，30条公共带，表现出丰富的遗传多样性，利用NTSYS2.1软件对统计结果进行分析，获得了31份材料的遗传聚类图。从聚类图可见，当遗传相似系数为0.41时，6号普通丝瓜、27号普通丝瓜及20号普通丝瓜聚为一类，说明普通丝瓜和有棱丝瓜存在丰富的遗传多样性，遗传相似系数值为0.41，将其定位于亚种更合适。当遗传相似系数为0.785时，A-24，A-15，A-4-2，C-11，DRZH-0聚为一类，5份丝瓜材料均为大肉瓜类型，当遗传相似系数为0.875时，A-11、09-Z-D-4、C-33、C-41-3、09-Z-D-5、A-24，A-15，A-4-2，C-11，DRZH-0共计10份丝瓜材料聚为一类，这10份材料均为大肉瓜类型，其余18份材料为长条绿皮有棱丝瓜，从单独小聚类可见，F-9、F-12-2来自05秋资s-11，E-33号、F-2来自06年转-13的后代，C-33、C-41-3来自05-M-24的后代；又如G26、G36分别来自06转16、06转12，其中亲本之一是相同的，说明SRAP标记可对不同来源材料和遗传进化作系统的聚类分析。

图1 引物em7me7对31份丝瓜的SRAP扩增图样 Figure 1 Polyacrylamide gel (4%) patterns of 31 Loofah SRAP with primer pairs of em7me7, M was DL1000

图2 31份丝瓜资源的SRAP聚类分析 Figure 2 Dendrogram by cluster analysis based on SRAP markers of 31 Loofah

2讨论
种质资源是新品种选育的基础(罗少波等, 2006, 广东农业科学, (1): 15-17)，丝瓜资源丰富，从表型上来分主要有有棱丝瓜和普通丝瓜两大类型，有棱丝瓜又分为长条绿皮有棱丝瓜和大肉瓜两种，为了从分子水平对丝瓜材料进行评价，本研究利用SRAP分子标记对31份丝瓜材料开展了遗传多样性研究，遗传多样性非常丰富，而且普通丝瓜和有棱丝瓜的遗传关系较远，本研究认为将普通丝瓜定位为丝瓜的亚种更合适。而且分子标记和田间表现较为吻合，说明SRAP标记较适合分析丝瓜的遗传多样性。这与前人利用ISSR (苏小俊等, 2010)和SRAP (崔竣杰等, 2012)分析丝瓜的结果比较接近，而和前人RAPD (夏军辉和向长萍, 2008)的实验结果存在差异。说明SRAP标记对丝瓜开展遗传多样性分析较为适用。本研究中的部分材料如：F-9、F-12-2来自05秋资s-11，E-33号、F-2来自06年转-13的后代，C-33、C-41-3来自05-M-24的后代；又如G26、G36分别来自06转16、06转12，均单独聚类，说明SRAP标记还适合丝瓜亲缘关系较近材料间的遗传分析。以上结果可见，SRAP可以作为丝瓜田间选育种的有效辅助手段，本研究的结果对丝瓜育种研究具有重要指导意义。

3材料与方法
3.1材料
供试材料：丝瓜重要性状资源31份，其中28份丝瓜为有棱丝瓜，3份为普通丝瓜；28份有棱丝瓜中18份丝瓜为长条绿皮有棱丝瓜，长棒形、皮色深绿；10份丝瓜为大肉瓜，短棒形、皮色绿白，有斑点(表1)。

表1 供试31份丝瓜材料 Table 1 A list of names of 31 Loofah

3.2方法
3.2.1 DNA提取
DNA 提取采用改良CTAB法，浓度为2%，参照陈洁等方法略作改动（陈洁等, 2008, 江苏农业科学, (5): 61-62, 269）。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及纯度，将每个样品浓度调至50 ng/Μl -20℃备用。

3.2.2建立丝瓜SRAP反应体系
本研究采用均匀设计方案，建立丝瓜SRAP反应体系，首先以普通丝瓜材料为模板，采用正交实验设计Ｌ₁₆(4⁵)在４个水平上对影响丝瓜SRAP反应的Taq酶、Mg^2＋、模板、dNTP及引物等5个因素进行了优化，建立了丝瓜SRAP-PCR的最佳反应体系(乔燕春等, 2008; 李莲芳等, 2011)。

SRAP扩增程序参照吴红等(2009)并略加优化，建立的适合本研究的扩增程序为：94℃ 5 min，1个循环；94℃ 1 min, 35℃ 1 min，72℃ 1.5 min，5个循环；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃延伸8 min。PCR扩增完成后，再在2%琼脂糖凝胶下电泳2 h，检测并拍照。

3.2.3遗传多样性分析
研究中，将供试的9条正向引物和11条反向引物，两两配对组合，组成99组引物对，以任意两份材料为模板，利用99个引物组合对材料进行PCR扩增，筛选出20对稳定扩增的引物组合(表2)，对31份丝瓜材料进行扩增，进一步在4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析。将PCR产物点样在4%聚丙烯酰胺上，通过在0.5×TBE缓冲液中以2000 v电压电泳1.0小时，通过干胶，数据采集、数据分析。利用NTSYS2.1 软件对采集数据进行UPGMA法聚类分析，得出31份丝瓜材料的遗传距离。

表2 筛选出扩增稳定的SRAP引物组合 Table 2  SRAP primer combinations with stable amplification profiles were selected

作者贡献
乔燕春和李莲芳是本研究的方案设计和直接实施者，完成论文初稿。林鉴荣协助完成实验和数据整理。李莲芳为本研究提供研究材料、技术和资金支持，并修改论文定稿。全体作者都阅读并同意最终文本。

致谢
本研究由广州市科信局科技攻关项目(2010Z1-E381)和广州市农业财政专项资金(2013.1-2014.12)共同资助。

参考文献
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