A PCR/LDR-Based Functional Molecular Marker of Rice (Oryza Sativa L.) Aroma Allele BADH2-E2

Chu Huangwei ¹　Cheng Can ¹　Tu Rongjian ¹　Zhou Jihua ¹　Niu Fuan ¹　Sun Bin ¹　Li Yao ^1,2　Yao Yao ^1,3　Huang Yiwen ^1,3　Luo Zhongyong ¹　Cao Liming ^1*

1 Institute of Crop Breeding and Cultivation, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai, 201403; 2 College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai, 201306; 3 School of Agricultural Sciences, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, 330000

* Corresponding author, clm079@163.com

Abstract　The loss-of-function of betaine aldehyde dehydrogenase 2 (BADH2) in rice leading to the accumulation of 2-acetyl-1-pyrrolidine (2AP), the substrate of enzymatic reaction, makes the rice flavor. The rice aroma allele BADH2-E2 has been widely used in aroma rice breeding in China. In this study, a PCR/LDR-based functional molecular marker was developed according to the 7bp deletion in the second exon of badH2-E2 aroma allele. Using PCR/LDR-based markers, the genotypes of Shenfan24, Shenfan26 and their F1 hybrids in the badH2-E2 locus could be accurately identified, and screening the F2 population derived from the cross of Shenfan24 and Shenfan26 shows that the segregation ratio of badH2-E2 positive homozygous, heterozygous and badH2-E2 negative homozygous were 1:2:1. The results of this study provide a new type of molecular marker for marker-assisted breeding and have certain application potential.

Keywords　Rice, Aroma gene, badh2-E2, PCR/LDR, Molecular marker

香米因其具有宜人香味，被视为稻米中珍品，深受消费者的喜爱，其销售的价格也往往高于非香稻米，具有重要的经济价值。随着生活水平的提高，市场对香米的需求量也日益增加，水稻(Oryza Sativa L.)香味性状的遗传调控机理和香米水稻品种的选育研究越来越受到研究人员的重视。研究发现，香味性状主要受第8号染色体上的一个隐性基因位点控制(Ahn et al., 1992)，Bradbury等人的研究发现，8号染色体上编码的甜菜碱醛脱氢酶2 (Badh2)基因与水稻香味直接相关，稻米香味的产生是由于Badh2的功能缺失导致，并报道了第一个导致水稻香味的突变等位基因badh2-E7，其第7外显子有8 个碱基的缺失和3个单核苷酸多态性 (Bradbury et al., 2005)。此后，又有一系列的香味突变等位基因被发现，据统计目前已知的香味等位基因有18个(Amarawathi et al., 2008; Shi et al., 2008;  Kovach et al., 2009; Shao et al., 2011; Shao et al., 2013; Ootsuka et al., 2014; Shi et al., 2014; He and Park, 2015)。在这些已知的Badh2等位基因中，badh2-E2等位基因的序列与正常的Badh2基因相比，在第2外显子缺失了7碱基，也导致Badh2失去功能，使稻米变香(Shi et al., 2008)。对不同Badh2等位基因香稻品种的分布区域进行研究发现具有badh2-E2等位基因类型的香稻品种只在中国有分布(Kovach et al., 2009)。因此，badh2-E2这一香味等位基因资源在我国的香稻品种选育中有较广泛的应用(许言福等, 2015)。

在传统育种中，香味水稻品种的选育主要通过米粒咀嚼法(Dhulappanavar, 1976)和KOH浸泡法(Sood and Siddiq, 1975)进行表型选择，然而这些方法依赖人的感官进行选择，在育种过程往往会因为判断的失误导致香味表型选择的失败。香米形成分子机理的研究成果，使得利用分子辅助选择育种进行香米水稻新品种的选育成为可能。根据badh2-E2等位基因在2号外显子有7个碱基缺失这一特点，开发的Indel分子标记可以可靠的在育种群体中选择出携带badh2-E2等位基因的株系(许言福等, 2015)，极大的促进了香米水稻新品种选育。

热稳定连接酶被发现后，发展出了LDR技术用于检测SNP位点(Barany, 1991)。在此基础上，有发展处理PCR/LDR技术，实现了在一个反应体系中对多个SNP位点进行同时检测(Belgrader et al., 1996; Khanna et al., 1999)。应用PCR/LDR技术对SNP或Indel位点的基因型检测时，首先需要进行PCR扩增相应的多态性位点，再用PCR产物进行LDR反应，最后LDR反应产物用ABI3730测序仪进行分析，根据荧光峰出现的位置，判断检测样品的基因型。目前PCR/LDR技术已经广泛的用于遗传疾病、病原微生物等诊断领域(Belgrader et al., 1996; Khanna et al., 1999; Favis and Barany, 2000)。然而，迄今为止还未见报道将这一技术用于农作物的分子辅助育种中开发分子标记。

KASP (Kompetitive Allele-Specific PCR)技术是近年来发展出的一种可用于SNP和Indel位点检测的分子标记技术，并且迅速的在许多的农作育种中得到了应用(Neelam et al., 2013; Pariasca et al., 2015; Rasheed et al., 2016; Steele et al., 2018; Yang et al., 2019)。然而KASP技术有一个缺点，就是不能多重化，在进行多个目的基因聚合育种时，需要对育种群体中的每个个体的多个基因位点的基因型进行单独检测。而PCR/LDR技术非常适合应用于设计多重标记，将多个基因位点的基因型在一个反应中进行检测，可以大大的节省分子标记辅助选择的工作量(Belgrader et al., 1996; Khanna et al., 1999; Favis and Barany, 2000)。因此PCR/LDR技术在农作物的分子标记l辅助选择中具有广阔的前景。

在本研究中，开发了一种基于PCR/LDR (Polymerase Chain Reaction/Ligase Detection Reaction) (Belgrader et al., 1996)技术的badh2-E2的功能性分子标记，该标记不需要进行琼脂糖或PAGE电泳，利用ABI3730测序仪即可准确快速的分辨出纯合或杂合的badh2-E2等位基因，提高了香稻品种选育的效率。

1结果与分析

1.1基于PCR/LDR技术的badh2-E2分子标记开发

PCR/LDR技术需要进行一轮PCR和一轮LDR。首先设计一对PCR引物E2-F和E2-R，扩增出包含badh2-E2和BADH2序列的多态性位点的DNA片段(图1)。第二步，用PCR扩增片段为模板进行LDR反应，在LDR反应体系中有3条探针，包括1条荧光标记探针Probe-FLO、1条badh2-E2等位基因特异探针Probe-E2和1条非badh2-E2等位基因特异探针badh2-NON。Probe-FLO探针由20个碱基和模板互补的序列和34寡聚核苷酸T组成，并且在3’端标记FAM荧光基团，5’端磷酸化；Probe-E2探针包含23个和模板互补的序列和34寡聚核苷酸T；badh2-NON探针则由23个和模板互补的序列和32寡聚核苷酸T组成；Probe-E2和badh2-NON的主要区别为badh2-NON序列包含badh2-E2等位基因缺失的7个碱基，且2者之间寡聚核苷酸T的长度不同(图1)。当样品的基因型为badh2-E2时，则Probe-FLO可以与Probe-E2连接，产生一条111 nt的寡聚核苷酸；当样品的基因型为非badh2-E2时，则Probe-FLO可以与Probe-NON连接，产生一条109 nt的寡聚核苷酸；而当样品在badh2-E2位点是杂合的情况，则LDR反应的产物有109 nt和111 nt两种寡聚核苷酸。最后，LDR产物通过ABI3730分析，根据FAM荧光出现的位置，可以准确的判断出检测样品在badh2-E2位点的基因型。

图 1 用于badh2-E2等位基因鉴定的PCR/LDR分子标记设计 注: E2-F: PCR扩增正向引物; E2-R: PCR扩增反向引物; Probe-FLO: 荧光标记探针, 3’端标记了FAM荧光基团, 5’端进行磷酸化; Probe-NON: 非badh2-E2等位基因特异探针; Probe-E2: badh2-E2等位基因特异探针 Figure 1 Design of PCR/LDR-based molecular marker for badH2-E2 allele identification Note: E2-F: Forward primer of PCR amplification; E2-R: Reverse primer of PCR amplification; Probe-FLO: Fluorescent labeled probe, which a FAM fluorescent groups were labeled at the 3’, and phosphorylated at the 5’; Probe-NON: Non badh2-E2 allele-specific probes; Probe-E2: Badh2-E2 allele-specific probe

1.2 PCR/LDR分子标记验证

本研究首先对两个杂交粳稻恢复系申繁24、申繁26的基因型进行检测，结果显示，申繁24的LDR产物长度为111 nt，申繁26的LDR产物长度为109 nt (图2)，说明申繁24含有badh2-E2等位基因，申繁26不含有badh2-E2等位基因，与预期的结果完全一致。

图 2 badh2-E2等位基因PCR/LDR分子标记的验证 Figure 2 Validation of PCR/LDR-based badh2-E2 allele molecular marker

为验证PCR/LDR分子标记是否为共显性标记，检测了申繁24和申繁26杂交F1代植株的基因型。结果显示F1代植株在badh2-E2基因位点的基因型是杂合的，对应的，其LDR产物中有109 nt和111 nt两种长度的寡聚核苷酸。根据检测图谱，可以清楚的判断出检测样品在badh2-E2基因位点的基因型是纯合的还是杂合的，说明PCR/LDR分子标记是共显性标记。

利用PCR/LDR分子标记对申繁24和申繁26杂交F2代群体66个株系的badh2-E2基因位点的基因型进行鉴定，结果有16个株系和申繁24一样为badh2-E2纯合基因型，有15个株系与申繁26一样不含有badh2-E2等位基因，而另外35个株系在badh2-E2位点表现杂合的基因型(图2)，结果符合1：2：1 (χ²=0.273, p=0.873>0.05)的分离比。这一结果进一步表明PCR/LDR分子标记能够准确的检测badh2-E2位点的基因型，适合用于标记辅助选择选育含有badh2-E2基因的香味水稻品种。

2讨论

在过去利用badh2-E2香味等位基因进行分子标记辅助育种研究中，主要利用badh2-E2香味等位基因2号外显子的7 bp的缺失设计的Indel标记对育种材料进行基因型的鉴定。基于PCR技术的Indel分子标记需要对PCR产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，进行基因型的判断，这类方法在操作过程中比较费时费力，不太适合大量样品的高通量检测。并且在实验过程中会用到溴化乙锭(EB)、丙烯酰胺或硝酸银等有毒试剂(Ramkumar et al., 2015)。

在本研究中，开发了一种基于PCR/LDR技术的用于检测badh2-E2香味等位基因的功能性分子标记，结果显示这个标记可以准确的分辨出携带badh2-E2基因的纯合及杂合株系，为香味水稻品种的标记辅助选择提供了一种新的技术手段。基于PCR/LDR的分子标记进行基因型的分析时，不需要进行琼脂糖或PAGE电泳，应用ABI 3 730测序仪对PCR/LDR产物进行基因型的分析。ABI3 730测序仪可以在大约2个小时的时间里，完成对96个样品的分析，大大的省略的基因型分析的工作量。

在现代作物育种，往往需要将多个重要性状的重要控制基因聚合到一个新的品种中，在传统的分子辅助育种中，需要对多个性状关联的分子标记进行分别检测，需要大量的工作量。而PCR/LDR技术非常的适合开发多重分子标记(Belgrader et al., 1996; Khanna et al., 1999; Favis and Barany, 2000)，可以在一个实验中完成对多个遗传位点基因型的分析，本研究的结果为在今后开展badh2-E2香味等位基因与其它功能等位基因聚合育种中开发多重分子标记奠定了基础。

3材料与方法

3.1供试材料

为了验证PCR/LDR分子标记的可靠性，本研究选用两个杂交粳稻恢复系申繁24、申繁26基因型进行检测，已知这两个恢复系中，申繁24具有badh2-E2等位基因，而申繁26不含有badh2-E2等位基因(程灿等, 2018)，本研究使用的F1代和F2代群体来源于申繁24和申繁26的杂交。

3.2 badh2-E2基因PCR/LDR标记的设计与合成

PCR/LDR标记需要进行PCR和LDR两步反应，第一步进行PCR扩增，第二步进行LDR反应，PCR引物和LDR反应的探针序列以及产物的长度(表1)，PCR引物和LDR反应的探针与模板DNA互补的位置(图1)。
 

表 1 PCR/LDR标记引物和探针序列 Table 1 Primers and probes sequences of PCR/LDR-based marker

3.3水稻叶片DNA提取以及标记检测

水稻叶片DNA用CTAB法提取，并用NanoDrop™ 2000微量分光光度计进行定量。PCR反应体系为25 μL，包含50 ng基因组DNA，上下游引物各0.5 pmol，dATP、dGTP、dCTP和dTTP 各200 μM，10 mM Tris-HCl (pH=8.8)，1.5 mM MgCl₂，50 mM KCl， 0.8% (v/v) NP-40和Taq DNA聚合酶5U。PCR反应程序为：95°C变性2 min，35个循环的94°C变性30 s, 56°C退火30 s, 72°C延伸30 s，最后72°C延伸5 min。

LDR反应的体系为10 µL，包含PCR产物4 µL，50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM NAD⁺，3条LDR探针各0.2 pmol和Taq DNA连接酶2 U。反应程序为95°C变性2 min，然后40个循环的94°C变性15 s，50°C退火和链接25 s。最后LDR产物用ABI3730 DNA测序仪进行分析。

作者贡献

储黄伟是本研究的主要执行人，完成数据分析；涂荣剑、周继华参与分子标记检测；牛付安、孙滨、李瑶、姚瑶、黄祎雯、罗忠永参与田间水稻的种植管理；曹黎明、程灿是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论文修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由上海市水稻产业技术体系建设(沪农科产字(2020)第3号)、国家科技部重点研发项目(2016YFD0101106)和上海市优秀技术带头人项目(18XD1424300)共同资助。

参考文献

Ahn S.N., Bollich C.N., and Tanksley S.D., 1992, RFLP tagging of a gene for aroma in rice, Theoretical and Applied Genetics, 84(7): 825-828

Amarawathi Y., Singh R., Singh A.K., Singh V.P., Mohapatra T., Sharma T.R., and Singh N.K., 2008, Mapping of quantitative trait loci for basmati quality traits in rice (Oryza sativa L.), Molecular Breeding, 21(1): 49-65

Barany F., 1991, Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase, Proc Natl Acad Sci USA, 88(1): 189-193

Belgrader P., Marino M.M., Lubin M., and Barany F., 1996, A multiplex PCR-ligase detection reaction assay for human identity testing, Genome Science & Technology, 1(2): 77-87

Bradbury L.M., Fitzgerald T.L., Henry R.J., Jin Q., and Waters D.L., 2005, The gene for fragrance in rice, Plant Biotechnol J, 3(3): 363-37

Dhulappanavar C.V., 1976, Inheritance of scent in rice, Euphytica, 25(1): 659-662

Favis R., and Barany F., 2000, Mutation detection in K-ras, BRCA1, BRCA2, and p53 using PCR/LDR and a universal DNA microarray, Annals of the New York Academy of Sciences, 906(1): 39-43

He Q., and Park Y., 2015, Discovery of a novel fragrant allele and development of functional markers for fragrance in rice, Molecular Breeding, 35(11): 217

Khanna M., Park P., Zirvi M., Cao W., Picon A., Day J., Paty P., and Barany F., 1999, Multiplex PCR/LDR for detection of K-ras mutations in primary colon tumors, Oncogene, 18(1): 27-38

Kovach M.J., Calingacion M.N., Fitzgerald M.A., and Mccouch S.R., 2009, The origin and evolution of fragrance in rice (Oryza sativa L.), Proc Natl Acad Sci USA, 106(34): 14444-14449

Neelam K., Brown G.G., and Huang L., 2013, Development and validation of a breeder-friendly KASPar marker for wheat leaf rust resistance locus Lr21, Molecular Breeding, 31(1): 233-237

Ootsuka K., Takahashi I., Tanaka K., Itani T., Tabuchi H., Yoshihashi T., Tonouchi A., and Ishikawa R., 2014, Genetic polymorphisms in Japanese fragrant landraces and novel fragrant allele domesticated in northern Japan, Breed Sci, 64(2): 115-124

Pariasca T.J., Lorieux M., He C., Mccouch S., Thomson M.J., and Wissuwa M., 2015, Development of a SNP genotyping panel for detecting polymorphisms in Oryza glaberrima/O. sativa interspecific crosses, Euphytica, 201(1): 67-78

Ramkumar G., Prahalada G.D., Hechanova S.L., Vinarao R., and Jena K.K., 2015, Development and validation of SNP-based functional codominant markers for two major disease resistance genes in rice (O. sativa L.), Molecular Breeding, 35(6): 129

Rasheed A., Wen W., Gao F.M., Zhai S.N., Jin H., Liu J.D., Guo Q., Zhang Y.J., Dreisigacker S., Xia X.C., and He Z.H., 2016, Development and validation of KASP assays for genes underpinning key economic traits in bread wheat, Theoretical and Applied Genetics, 129(10): 1843-1860

Shao G.N., Tang S.Q., Chen M.L., Wei X.J., He J.W., Luo J., Jiao G.A., Hu Y.C., Xie L.H., and Hu P.S., 2013, Haplotype variation at Badh2, the gene determining fragrance in rice, Genomics, 101(2): 157-162

Shao G.N., Tang A., Tang S.Q., Luo J., Jiao G.A., Wu J.L., and Hu P.S., 2011, A new deletion mutation of fragrant gene and the development of three molecular markers for fragrance in rice, Plant Breeding, 130(2): 172-176

Shi W.W., Yang Y., Chen S.H., and Xu M.L., 2008, Discovery of a new fragrance allele and the development of functional markers for the breeding of fragrant rice varieties, Molecular Breeding, 22(2): 185-192

Shi Y.Q., Zhao G.C., Xu X.L., and Li J.Y., 2014, Discovery of a new fragrance allele and development of functional markers for identifying diverse fragrant genotypes in rice, Molecular Breeding, 33(3): 701-708

Sood B.C., and Siddiq E.A., 1975, A rapid technique for scent determination in rice, Indian Journal of Genetics & Plant Breeding, 38(2): 268-275

Steele K.A., Quinton T.M.J., Amgai R.B., Dhakal R., Khatiwada S.P., Vyas D., Heine M., and Witcombe J.R., 2018, Accelerating public sector rice breeding with high-density KASP markers derived from whole genome sequencing of indica rice, Molecular Breeding, 38(4): 38

Yang G.L., Chen S.P., Chen L.K., Sun K., Huang C.H., Zhou D.H., Huang Y.T., Wang J.F., Liu Y.Z., Wang H., Chen Z.Q., and Guo T., 2019, Development of a core SNP arrays based on the KASP method for molecular breeding of rice, Rice, 12(1): 21

Cheng C., Yang J., Zhou J.H., Niu F., Hu X.J., Tu R.J., Luo Z.Y., Wang X.Q., Cao L.M., Chu H.W., 2018, Functional Molecular Marker-based Identification of Fragrant Parents of Japonica Hybrid Rice (Oryza Sativa L.), Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 16(17):5653-5659 (程灿, 杨佳, 周继华, 牛付安, 胡雪娇, 涂荣剑, 罗忠永, 王新其, 曹黎明, 储黄伟, 2018, 基于功能性分子标记鉴定香味杂交粳稻亲本, 分子植物育种, 16(17): 5653-5659)

Xu Y.F., Huang J., Wang Y.C., Wang J., Li J.Y., 2015, Development of Two Molecular Markers used to Detection of badh2-E2 Fragrant Gene in Rice, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 13(11): 2441-2445 (许言福, 黄菊, 王英存, 王杰, 李建粤, 2015, 两种筛选水稻badh2-E2类型香味基因分子标记的建立, 分子植物育种, 13(11): 2441-2445)