Quantitative Trait Locus Locating Analysis of Bud Set time in an F₁ Hybrid Population of Populus deltoides and Populus simonii

Zhao Wei　Wu Hainan　Gao Hua　Wang Deyuan　Xu Houxi 　Ou Jiajia　 Wang Ying　Tong Chunfa ^*

Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037

* Corresponding author, tongchf@njfu.edu.cn

Abstract　Growth and dormancy are the two most important biological processes in the life cycle of perennial plants. Studying dormancy-related traits is of great significance for understanding the adaptability of forest growth and improving the efficiency of plant molecular breeding. In order to reveal the genetic mechanism of poplar bud set, we performed quantitative trait locus (QTL) locating analysis of the trait with the KW method in the software MapQTL, based on the F₁ hybrid population derived from a cross of Populus deltoides and Populus simonii and the two parental linkage maps. As a result, 15 QTLs controlling bud set were identified distributing on 7 linkage groups, among which 12 QTLs were located in linkage groups LG-1, LG-7, LG-9, LG-11 and LG-15 on the maternal P. deltoides map, whereas the other 3 QTLs were distributed in linkage groups LG-9 and LG-12 on the paternal P. simonii map. According to the location of the QTLs on the P. trichocarpa genome, a total of 45 candidate genes for bud set were identified. Furthermore, GO and KEGG enrichment analyses revealed that 71% of the candidate genes possessed potential functions in light and hormone signal transduction pathways. The research results provide a valuable resource for exploring the genes involved with bud set in poplar and for the application in molecular marker-assisted breeding.

Keywords　Poplar, Bud set, QTL mapping, Candidate genes

生长和休眠是多年生植物生命周期中两个重要的生物过程，也是植物对环境适应的综合体现。大多数植物所处的环境存在明显的季节变化，四季的差异在温度和光照时间上十分明显(Leith, 1975; Vitasse et al., 2014)。林木中重要的性状如芽休眠和芽萌发受当地气候影响较大，如果没有自我保护或者防御性的机制，植物的生长发育过程就会受阻或致死。植物抵抗严寒或度过干热最常见的防御机制就是休眠，休眠是植物整体或某一部分生长极为缓慢或暂时停顿的一种现象(Vegis, 2003)。当多年生木本植物遇到不良环境时，表现为节间缩短，新叶停止抽出，形成驻芽，并在芽的外层有芽鳞等保护结构，以便度过低温或干燥的环境；来年温度升高后，芽鳞脱落，新芽伸长或抽出新枝叶。

作为多年生落叶植物度过干燥和严寒天气的关键阶段，驻芽时间对林木的生长发育具有决定性的作用(Benvenuti et al., 2001; Way and Montgomery, 2015)。在农林生产中，如果驻芽时间过晚，植物容易受到冻害；驻芽时间过早，植物往往会出现生长周期缩短、生物量减少、发芽率低等情况，使其竞争能力和增长潜能下降，从而降低木材产量和品质(Larson and Isebrands, 1972)，严重影响了育种工作。因此，研究林木休眠规律，掌握驻芽时间的遗传机制，对提高林木育种效率和优良品种选择具有重要意义(Chen et al., 2002)。

杨树基因组较小，遗传转化效率高；种内、种间易杂交，F₁代即可建立大量的分离群体(Stettler et al., 1980; Bradshaw et al. 1994)；生长迅速，营养繁殖容易(Navarro et al., 2014; Sabatti et al., 2014)，可作为数量性状基因位点(quantitative trait locus, QTL)定位研究的模式物种(Zhou et al., 2015)。随着全球气温逐年攀升，由气候变暖影响芽生长的事件愈加频繁。为了预测全球气候变暖带来的影响，已发展了多种研究芽休眠的模型(Hänninen, 1990; Kramer, 1995; Chuine and Rousseau, 1999)，但是关于杨树驻芽遗传机制的研究报道还比较少。Bradshaw和Stettler (1995)及Frewen等(2000)最早在毛果杨´美洲黑杨(P. trichocarpa ´ P. deltoides)家系内检测到4个与驻芽时间相关的QTL；此后，Rohde等(2011)在4个杨树家系内重复地检测到6个与驻芽相关的区域。但由于前人研究的分子标记数目有限，构建的遗传图谱密度较低，对于控制杨树驻芽时间的基因数目以及其作用效果的研究十分有限。本研究用美洲黑杨和小叶杨杂交F₁代为材料来研究杨树驻芽相关的QTL。美洲黑杨具有生长迅速、抗黑斑病且材质优良等特点，但其生根能力弱，适应性较窄，抗盐碱和耐寒耐旱性较差(Zhang et al., 2009)；小叶杨具有抗寒、抗旱、抗盐碱且根系发达等特点，但其生长缓慢、干形弯曲经济价值不高(Wei et al., 2011)。两者在多数性状上差异很大，杂交可获得理想的作图群体。利用该群体已构建的高密度高质量遗传图谱(Yao et al., 2018)，本研究探索SNP位点与驻芽时间的遗传相关性，揭示影响杨树驻芽时间的遗传机理，为杨树分子标记辅助育种提供参考依据。

1结果与分析

1.1驻芽时间表型数据分析

我们收集到了美洲黑杨和小叶杨杂交F₁代297个个体驻芽时间数据，其频率分布直方图，偏度值为-0.60，峰度值为1.41，可以看出驻芽时间呈偏斜分布(图1)。最早驻芽时间为9月20日(DOY=264)，最后一次驻芽时间为11月1日(DOY=306)，驻芽从开始到结束持续了43 d。父本小叶杨驻芽时间最早，母本美洲黑杨驻芽时间最晚，子代驻芽时间介于两亲本之间。从频率分布趋势可看出，杨树驻芽时间遗传变异较大，符合数量性状遗传特征，可用于数量性状基因定位研究。

图 1 美洲黑杨´小叶杨群体杂交F1代驻芽时间直方图 Figure 1 Histogram of the bud set time in the F1 hybrid population of P. deltoides ´ P. simonii

1.2驻芽时间的QTL定位分析

基于已经构建的美洲黑杨和小叶杨高密度遗传连锁图谱，使用MapQTL6软件中的Kruskal-Wallis (KW)方法来对子代驻芽时间性状进行QTL定位分析。每个SNP标记位点得到了显著性检验的概率值，即所谓的P值。经BH方法校正，确定了显著性临界值为P= 0.0 017，对应的-log₁₀P=2.80。图2是以亲本遗传图谱图距为横坐标、P值的以10为底对数负值为纵坐标的散点图。若遇到超过临界值的标记较多，则以50cM为一个单位(大于50 cM两标记之间认为无连锁)，搜索单位内的峰值作为与驻芽时间相关的QTL。

图2 美洲黑杨´小叶杨群体杂交F1代驻芽时间QTL定位中SNP的P值对数负值对在(A)母本美洲黑杨遗传图谱上和(B)父本小叶杨遗传图谱上位置的散点图 注: 红色虚线表示P值对数负值的临界值, 红点标记显著的QTL Figure 2 The scatter plot of negative logarithm of the P value against the position on the genetic maps of the (A) maternal P. deltoides and (B) paternal P. simonii for each SNP in the QTL analysis for bud set time in the F1 hybrid population of P. deltoides ´ P. simonii Note: The dotted red line represents the threshold of negative logarithm of P value and the red dot indicates significant QTL

共检测到15个与杨树驻芽时间性状显著相关的QTL，其中12个QTL被定位到母本美洲黑杨的遗传图谱上，位于LG-1、LG-7、LG-9、LG-11和LG-15上；另外3个QTL被定位到父本小叶杨的遗传图谱上，位于LG-9和LG-12上。表1列出了每个QTL在遗传图谱上的连锁群、标记区间、遗传距离以及物理距离。其中QTL在遗传图谱上最小的区间为6.91 cM，最大的区间为31.07 cM；在基因组上最小物理区间长度为203.93 Kb，最大物理区间长度为2 399.64 Kb，平均长度为853.18 Kb。与Rohde等(2011)定位区间的平均长度5 651.034 Kb和Fabbrini等(2012)定位区间的平均长度6 212.698 Kb相比，已经在很大程度上缩小了定位的区间，提高了定位的准确性。

1.3候选基因

对QTL附近两个标记区间内的基因使用Blast2go软件进行了重新注释，发现有45个与杨树驻芽时间相关的候选基因(表1)，其中包含10种功能基因，这些基因功能及其基因ID和对应的参考文献如表2所示。在杨树休眠相关的研究中，脱落酸(Rohde and Bhalerao, 2007)、乙烯和赤霉素(Howe et al., 2015)已分别在欧洲山杨´银白杨(P. tremula ´ P. alba)家系和毛果杨(P. trichocarpa)家系内被证实在植物停止生长和休眠过程中起作用，Baba等(2011)也在杂交山杨(P. tremula ´ P. tremuloides)家系内发现生长素的应答反应同样参与了这一过程。本研究发现了5个与脱落酸有关的候选基因，7个调控乙烯的基因，7个与赤霉素相关的基因和4个与生长素应答因子相关的基因。除了激素调控相关基因，我们还检测到9个与光信号转导相关的基因和7个与冷调控相关的基因。这些基因在欧洲山杨´银白杨(Ruttink et al., 2007)、黑杨(Fabbrini et al., 2012)和毛果杨(Howe et al., 2015)等家系内芽休眠相关的研究中已有报道。其他候选基因相关的功能以及相关参考文献详细信息(表2)。

表1 美洲黑杨´小叶杨群体杂交F1代驻芽时间的QTL概况 Table 1 Summary of QTLs for bud set time in the F1 hybrid population of P. deltoides ´ P. simonii

 

表2候选基因功能信息 Table 2 The functional information of candidate genes

我们进一步对筛选的候选基因进行GO富集分析和KEGG富集分析。45个候选基因一共富集到73个显著的GO词条，这些GO词条大致分为三类，分别是生物过程(Biological processes)，细胞组成(Cell components)和分子功能(Molecular functions)，其中65个富集的词条与生物过程相关，6个与细胞组成相关和2个与分子功能相关。图3是从中筛选出20个与光应答、温度应答、冷应答、植物激素应答、发育过程、生物调节、植物器官发育等相关的词条并绘制的气泡图。GO富集分析结果表明杨树驻芽与应激反应和发育过程存在紧密联系。对候选基因进行KEGG富集分析，有19个候选基因被富集到11个通路中，包含3个类别的一级代谢途径，分别为新陈代谢(Metabolism)、遗传信息处理(Genetic Information Processing)和环境信息处理(Environmental Information Processing)，一级代谢途径又细分为5个二级代谢途径。全部预测通路信息如图4所示，其中仅有二萜生物合成(Diterpenoid biosynthesis)的通路是显著的。KEGG富集结果表明二萜生物合成在杨树驻芽发生的过程中起重要作用。

图3 候选基因的GO富集分析 Figure 3 GO enrichment analysis of candidate genes 注: 横坐标表示GO词条的P值, 纵坐标为GO词条内容, 圆圈大小代表在GO数据库中搜索得到的基因数目 Note: The abscissa represents the P value of each GO term, the ordinate represents the contents of the GO term, and the circle size represents the number of genes searched in the GO database

图4 候选基因的KEGG富集分析 Figure 4 KEGG enrichment analysis of candidate genes

2讨论

在农林生产实践中，林木的季节性休眠具有重要的意义(Chen et al. 2002)。为了更好的了解芽休眠的特征和探索其在植物分子育种中的应用，很有必要探究驻芽的遗传机制。Bradshaw和Stettler (1995)研究证实杨树驻芽时间受遗传因子控制，易受环境因子影响。Frewen等(2000)在美洲黑杨´毛果杨杂交群体内调查驻芽时间，其驻芽开始到结束共持续了98 d，本研究的调查结果与前者相差很大，因为地理起源和气候条件不同，导致驻芽时间存在差异。Fabbrini等(2012)在黑杨家系内研究杨树芽休眠相关性状，将杨树停止生长到形成驻芽的过程划分为七个阶段，结果显示在最后形成驻芽阶段，基因和环境交互的作用效果最弱，表明控制杨树形成驻芽的阶段主要由遗传基因控制，但其遗传机制比较模糊。本研究选择形成驻芽的时间进行QTL定位分析，所选材料不同，遗传背景不同，虽然遗传参数存在差异，但仍然可为数量性状基因定位分析提供重要的信息。

Chen等(2002)研究杨树休眠相关的性状时，由于分子标记种类和数目有限，构建的遗传图谱划分成了35个连锁群，存在同一条染色体被划分成不同的连锁群，结果没有检测到可以解释大多数表型变异的QTL。本研究采用的遗传图谱可以精确地划分为19个连锁群，在很大程度上可提高QTL定位的准确性。Frewen等(2000)在美洲黑杨和毛果杨的杂交F₂代家系中，定位到了4个与驻芽时间相关的QTL，位于LG-3、LG-6和LG-10上；Rohde等(2011)在4个杨树家系内定位到了53个与驻芽时间相关的QTL，位于LG-3、LG-5、LG-6、LG-8和LG-13上；Fabbrini等(2012)也在黑杨家系内定位到16个与驻芽时间相关的QTL，位于LG-1、LG-3、LG-4、LG-6、LG-7、LG-10、LG-11、LG-13、LG-16、LG-17、LG-18、LG-19上。较前人研究，本研究共同定位到LG-7和LG-11，在不同家系和不同环境内反复检测到的QTL区域，可作为控制驻芽时间的重要基因组区段。然而，前人研究共同定位到LG-3和LG-6，本研究并没有定位到。究其原因，第一，分子标记不同，SNP标记较AFLP、SSR等标记遗传稳定，可提供的变异位点多且提供的基因型信息完整；第二，计算模型不同，构建的高密度遗传图谱覆盖信息广泛，很少留有空白区域，因此本研究没有采用区间作图法来进行QTL定位而是直接对每个标记进行检测(颜吉强, 2019)，。由于分子标记和表型数据之间可能存在虚假关联，后经BH方法校正，减少了假阳性，提高了检测效率和精度；第三，群体数量不同，一个较大的研究群体不仅可以提高QTL定位研究的精度，也能提高QTL研究的检测能力(Doerge, 2002)。本研究选取297个个体，已涵盖较多变异位点和遗传信息，可提供可靠的定位信息。后续研究可以收集多年表型数据，进行多年的QTL定位分析，多年均可筛选到的基因可以作为调控杨树驻芽时间的重要基因，进一步挖掘并运用到林木生产实践中。

一旦确认QTL在基因组上的位置，就可以根据位置找到QTL附近的基因，对基因进行功能注释。Chen等(2002)研究表明驻芽发生受植物激素、光周期、外界温度、植株生长速率、展枝情况、病虫害等因素影响。与前人研究相比，本研究检测到71%的候选基因与植物激素信号转导和光信号转导有关，并未检测到与光周期调控相关的基因。可能存在的原因有：一方面有所选材料在自然条件下生长时土壤含水量或管理不当所引起的误差；另一方面所采用的计算方法不同，需进一步的优化算法。杨树驻芽时间的精细定位，将有助于全面识别调控驻芽时间的基因，为杨树种质资源的开发与利用以及全球气候变暖情况下提高林木适应性的分子育种提供科学依据。

3材料和方法

3.1作图群体

作图群体为美洲黑杨(I-69杨, P. deltoides)和小叶杨(P. simonii)杂交F₁代，母本I-69杨位于江苏省泗阳农场，父本小叶杨位于河南省洛阳市洛宁境内。2009~2011年初春，收集父本小叶杨花粉，在江苏省泗阳农场选择2株生长健壮的I-69杨作为母本，进行连续三年的人工授粉，杂交获得F₁代500个左右单株，种植于南京林业大学下蜀林场(Tong et al., 2016)。

3.2表型数据收集

根据Frewen等(2000)的方法记录子代单株驻芽时间，记录从2011年12月31日到驻芽时间的天数，用DOY (Day of the year)表示。从2012年9月开始，以植株不再生长(无嫩叶伸展)、茎尖顶芽(驻芽)封闭、且有芽鳞包被、顶芽变为红棕色为标准，每隔一周在同一时间记录各子代单株驻芽的时间，直至所有单株都形成驻芽。

3.3驻芽时间QTL定位

选择美洲黑杨和小叶杨杂交F₁代中的297个个体作为作图群体以及先前构建的两个亲本高密度遗传图谱(Yao et al., 2018)，利用MapQTL 6 (Van Ooijen, 2009)软件中非参数Kruskal-Wallis (KW) (Lehmann, 1975)的方法对驻芽时间性状进行QTL定位分析。美洲黑杨和小叶杨的遗传图谱分别含有4 018和2 097个SNP标记(Yao et al., 2018)。由于所测驻芽时间数据偏离了正态分布，并且没有对数量性状的概率分布做任何假设，所以选择KW方法来进行QTL定位(Jorge et al., 2005; Hanley et al., 2011; 戴美丽等, 2019)。为了探究SNP标记位点与驻芽时间之间的显著性关系，对于特定的SNP标记位点，KW检验首先对子代个体按标记基因型分类，并将个体的数量性状值从小到大排序；通过计算各组内秩的平方和，再除以总均方便可获得K值，在零假设条件下，K近似服从自由度为K-1的X²(K-1)分布，可根据卡方值计算每个SNP位点的P值，P值反映了SNP位点与驻芽性状之间的相关程度，当P<0.0005时，认为该标记是与性状显著相关的。由于标记与表型数据间可能存在虚假关联，进一步采用多重检验中的BH方法来矫正P值以减少假阳性(Benjamini and Hochberg, 1995)。BH方法首先将所有SNP对应的P值从小到大排列，然后按公式Q=P*(m/k)计算Q值，其中m为检验的次数即SNP位点的数量，k为P值在排列中的位数。当某个SNP的Q值大于紧邻其后的Q值，那么该SNP的Q值修正为其后的Q值。当SNP的Q值小于显著水平0.05(对应p=0.0 017)，则认为该SNP与驻芽时间显著关联。

QTL的命名参照McCouch等(1997)创制的命名系统，具体方法为“q+性状英文缩写+连锁群号+QTL的序号”。

3.4候选基因研究

为了筛选与驻芽时间相关的候选基因，本研究从绿色植物基因组数据库Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/)下载毛果杨(P. trichocarpa) v4.1版本的全基因组序列，用于寻找每个QTL物理区间内的编码基因。首先确定显著的SNP在毛果杨基因组上的位置，提取对应的物理区间内的所有编码序列(CDS)。其次，用Blast2go (Conesa et al., 2005)软件将提取的基因序列与Nr数据库进行比对，并进行基因功能注释，挖掘与芽休眠相关的基因。最后，对相关的基因进行GO (gene ontology)富集分析(Ashburner et al., 2000)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析(Ogata et al., 1999)，筛选出与驻芽相关的候选基因。

作者贡献

赵薇是本研究的执行人并负责论文初稿的写作，吴海楠和高华参与数据分析以及论文修改；王德源、徐后喜、欧佳佳和王莹参与田间性状调查和田间管理，童春发是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(31870654)和江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)共同资助。

参考文献

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