Research Advances in Cytology and Molecular Cytogenetics of Cymbidium

Xu .H., Chen Y., and Hu F.R.,

1 College of Landscape Architecture, Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037; 2 Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, 310021

* Corresponding author, hufengrong2003@sina.com

Abstract　As an important ornamental flower, Cymbidium is a good model group for studying the floral organ differentiation of angiosperms. At present, studies on chromosome evolution of Cymbidium are very limited, and the process of speciation and evolution is still unclear. Some species or varieties still lack cytological markers such as centromeres, telomeres and nucleolar tissue regions. In view of this, the review summarized the progress in chromosome ploidy, karyotype, chromosome behavior, FISH, epigenetic markers and molecular markers of Cymbidium based on the conventional cytology and molecular cytogenetics, hoping to to provide theoretical reference for systematic study and cross breeding of Cymbidium, and provide basis for cytology and taxonomic research.

Keywords　Cymbidium, Cytology, Chromosome, FISH, Molecular markers

兰属(Cymbidum)隶属兰科(Orchidaceae)树兰族(Trib. Epidendreae)，下设兰亚属(Subgen. Cymbidium)、大花亚属(Subgen. Cyperorchis)、建兰亚属(Subgen. Jensoa) 3个亚属，具有极高的观赏价值和深厚的兰花文化(中国科学院中国植物志编辑委员会, 1996)。但兰属植物由于存在自然杂交的缘故，中间类型颇多，变异较大，种的界限不甚明确，为属内种的分类和整理带来了极大的困难。

吴应祥在1991年第一版的《中国兰花》中，将中国兰属定为29种，而在该书1993年的第二版中则修订为31种，并将这31个种划分为5个组2个亚组(吴应祥, 1993)；陈心启等(1998)认为国内兰属有29种和一些变种，其中27种与吴应祥1993年第二版的相同。Du和Cribb (1988)系统将全属全球共48种植物分为3个亚属和14个组， 后在2007年又增加到52种(Du et al., 2007)，陈心启在此基础上将国内的29种又分为3个亚属11个组；1998年，黄家平、戴思兰(2003)又用R分析对兰属的37个种、变种及品种和37个形态特征性状进行了数量分类研究，将其大致分为兜瓣型、竹叶瓣型、多花型、素心瓣型和奇瓣型5大类；后杨冬之等(2007)采用“二元分类法”将叶艺和花艺性状初步确定为国兰品种分类的第一级标准，花色、花部结构则分别作为第二、三级分类标准。另外，该属中还有许多新种正在被挖掘，如刘仲健等于2000年发表了一个兰属的新种——福兰(Cymbidium devonianum)，并发现该种在全属已知的种类中，尚难找到其明显的近亲；2006年，Liu等又发现了腋花组的一个新种——丽花兰(C. concinnum) (刘仲健等, 2006)。以上分类系统和新种鉴定均根据形态学指标进行判定，目前为止，兰属究竟有多少种和变种尚无定论，在形态学分类上存在分歧，缺乏一套基于细胞分类学的分类体系。

为阐明兰属种的形成、演化及种间亲缘关系，不同研究者从各个角度展开了大量的细胞学与分子细胞遗传学研究。本研究从染色体倍性及核型分析、染色体分带、减数分裂行为、荧光原位杂交、表观遗传标记和分子标记等6个方面对兰属植物的相关研究进展进行了综述，以期对兰属植物的系统分类研究及遗传改良提供一定的理论参考。

1染色体倍性及核型分析

据收集整理的文献资料来看，兰属植物约有40~50种，其中中国约有29种 (中国科学院中国植物志编辑委员会, 1996)。它们以染色体基数10形成一个二倍体到四倍体的多倍体系列，其中杂交培育的大花蕙兰(C. hybridium)系列存在种内多倍体，部分种的倍性尚无记载。兰属植物的核型以中部着丝粒染色体(m)最多，其次分别为近中部(sm)染色体，极少出现近端(st)和端着丝粒染色体(t)，核型类型以2B型居多，对称性较高。目前国内对于兰属植物染色体核型的分类常采用Levan标准(Levan et al, 1964)，国外多采用 Battaglia标准(Battaglia, 1955)，可看出兰属植物种或变种在分类系统中的位置、种源地分布及其染色体的倍数性、核型公式和核型类型(表1)。

表 1 兰属植物的倍数性、核型及种源分布 Table 1 Ploidy, karyotypes and provenance distribution of Cymbidium

国内外对于兰属植物染色体倍数性的结果较为一致，除独占春和杂交种大花蕙兰外均为二倍体；但核型研究结果存在较大差异，如Ning等(2018)对春兰(C. goeringii)种内5种不同品种的研究存在很大的分歧，1B、2B、2C型染色体均有出现；李玉阁等(2003)、冷青云等(2009)和Sharma等(2010)对独占春(C. eburneum)核型分析的结果也不一致，推测可能是种源地不同导致类似结果的出现。另外，通过核型结果及形态差异匹配来看，兰属植物的细胞学与形态学之间并不存在重要关联，不同亚属、不同组植物的聚类结果与形态学分类结果并不一致，甚至与进化关系也相悖(李玉阁等, 2002a; 李玉阁等, 2002b; 王丰妍, 2010; 王丰妍等, 2010; Sharma et al, 2012b; Younis et al, 2013)。目前在其他植物中已有发现，染色体数目和倍性可能与植物的花期、花径和花色等指标相关(Endo, 1969; 李懋学等, 1983)，本属植物中已开展探究大花蕙兰染色体倍性与花期的关系(Hwang et al, 2016)，后期对于兰属植物宏观形态学及微观细胞学的各类参数仍需继续探究。

近年来，以兰属中大花的种类为父母亲本，杂交培育出来的大花蕙兰系列，具有很高的观赏性及经济价值，是当今花卉销售平台上最受欢迎的品种之一。大花蕙兰品种大多为二倍体或四倍体，多花兰(C. floribundum)、冬凤兰(C. dayanum)和硬叶兰(C. bicolor)等均为大花惠兰的重要亲本。更有研究者将其进行进一步的杂交：冷青云等(2009)对具有50%建兰(C. ensifolium)、12.5%美花兰(C. insigne)和6.25%独占兰血统的属内品种小金童(C. golden Elf ‘Sundust’)进行核型分析，得出其核型公式为2n=2x=40=34m+6sm，属2B型，且发现该品种在第17对染色体短臂有随体；王丰妍等(2010)将4种从韩国引进的大花蕙兰品种与国内栽培的国兰优良品种杂交，杂交后代中出现二倍体和三倍体，而二倍体杂交后代虽与亲本的染色体倍性相同，但在染色体相对长度、平均臂比及不对称系数等指标上都趋于父母本的中间值，形态具有双亲特点，因此这4个F1代杂交种均可鉴定为真杂种。随后又有更多的杂交新品种出现(朱根发, 2005; Kim et al, 2006a; Kim et al, 2006b; Kim et al, 2007; Kyung et al, 2009; Lee et al, 2015; 李玉萍等, 2015; Hwang et al, 2016; Baek et al, 2019)，尽管关于它们的染色体研究较少，但仍为兰花新资源的开发做出了一定的贡献。

2染色体行为、分带及荧光原位杂交

2.1染色体行为研究

染色体行为是指在细胞分裂时染色体的复制、分裂和移动，以及在繁殖时同源染色体的交叉互换，减数分裂等行为。染色体行为异常可能导致非整倍体的形成、染色体的结构变异、细胞病变和花粉育性等存在一定的相关性(Roxas et al., 1995)。目前关于兰属植物染色体行为的研究尚不完善，仅见于Sharma等(2012a)报道的3种兰属植物花药绒毡层的核内有丝分裂。实验结果表明，它们的有丝分裂受到抑制，核膜没有消失，但中期染色体比正常有丝分裂时更为浓缩，核仁在整个核内分裂周期中持续存在。同时，研究者还认为45S rRNA基因在核内有丝分裂过程中的物理定位可能会有助于确认其非典型活性，便于深入了解绒毡层的多倍体化过程和程度，同时，对DNA甲基化水平的分析也有助于理解在核内分裂过程中核仁在纺锤体形成中的作用(Sharma et al., 2012a)。

2.2染色体分带及其他细胞学标记

尽管目前已有众多关于兰属植物染色体核型的报道，但几乎相同的染色体数目(2n=40)和极小的染色体形态差异阻碍了物种之间明确的区分。如今，新型的细胞和分子遗传学技术能够精确的对染色体进行定位和标记，以比较不同物种间的种系发育关系 (Heslop-Harrison, 2000)，利用这些技术进行染色体分析已成必然，基于荧光原位杂交技术的染色体进化研究是解析兰花亲缘关系建成的一项有力工具。

兰属植物的核DNA在单子叶植物中是独一无二的，在中性CsC1密度梯度中显示出一个富含AT的卫星，原位杂交和AT特异性荧光染料显示染色中心有许多不同类型的异染色质区域(Nagl, 1977)；2012年，Sharme等(2012c)利用FISH(fluorescence in situ hybridization)技术，以pTa71 45S rRNA作探针对来自印度东北部的8个兰属不同物种中的45S位点进行了定位，除纹瓣兰(C. aloifolium)和斑舌兰(C. tigrinum)各有4对和5对45S rDNA信号以外，其他6种植物仅存在1对信号；且所分析植物中仅有1对染色体存在NOR位点，且可能具有转录活性。另外，Sharma和Mukai (2015)指出双修饰anti-H3S10phK14ac组蛋白和H3S10ph标记了兰科植物染色体着丝粒周围的染色质，而组蛋白H3T3ph苏氨酸磷酸化在有丝分裂和减数分裂期间标记了整个染色体臂；在花粉有丝分裂I期发生动态“减数-有丝分裂转移”时，组蛋白修饰染色体的分布以及由此产生的营养细胞和生殖细胞也揭示了磷酸化在兰花小孢子发生过程中的作用。

关于染色体分带技术的研究仅见于Schwarzacher等(1980)对兰属两个品种进行的初步测试，结果表明Giemsa C-带适合兰花，能够观察到较清晰的带型。而以位于核仁组织区的45D rDNA为探针进行荧光原位杂交时, 杂交信号数相当于基因组里附随体的染色体数，并且，每个染色体组平均杂交信号出现的频率越高表明该种越原始(Abdel and Kondo, 2003)，相比而言，染色体分带技术如CMA荧光分带虽也能展现核仁组织区的信息，但条带数常比FISH中45S rDNA的杂交信号数少, 且准确性也较低，由此推测后续研究仍将以荧光原位杂交及其他分子细胞遗传标记技术作为重点。

3基于分子标记的遗传多样性研究

植物的形态特征往往受到生长环境和发育阶段的限制，染色体等细胞学研究也会受测量误差等影响，而现如今出现的分子标记技术，是以遗传物质为依据，从物种基因组DNA水平直接反应种间和种内的差异，为分类鉴定提供了高效、准确且清晰的方法(朱根发和郭振飞, 2004 ;黄龙花等, 2011; 蹇黎, 2011; 魏霜等, 2014)。兰属植物在育种中运用的简单重复序列间扩增技术(inter-simple sequence repeat, ISSR)、随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA, RAPD)和相关序列扩增多态性技术(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)等，对研究兰属植物的遗传多样性和亲缘关系，及对合理保护其种质资源、探讨遗传关系和培育新品种具有重要意义。

多个研究者的分析结果均显示，兰属植物的种质资源多样性十分丰富。高丽和杨波(2006)对湖北省的11个春兰野生居群内的325个体用ISSR分子标记进行遗传多样性水平的研究，11对引物共检测到127个位点，表明春兰的遗传变异程度远高于其他兰科植物；同时，春兰虽自交亲和，但异交仍是其自然界繁育系统中的主要遗传模式，为追求稳定遗传，该研究组又对来自叶艺春兰同一母株并经多次无性繁殖获得的组培苗，采用ISSR分子标记技术进行基因组DNA分析，结果表明，组培苗在多次继代培养的过程中，遗传物质稳定，顺利保留母株的特性(高丽和杨波, 2006)。Huang等(2010)利用13对简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)引物对春兰、蕙兰和建兰等6个种103个品种的遗传多样性和亲缘关系作EST-SSR分析，13对SSR引物共产生了168条多态性条带，平均每条引物6~24个条带不等，也清晰的显示兰属种内及种间品种的多样性。

大部分分子标记技术的使用是通过遗传多样性分析将兰属植物重新归类或进行分类鉴定，如王晓英和王长宪(2014)利用AFLP技术将同种的品种聚在一起；高岭等(2013)采用SCoT对兰属14个种的24个样品进行划分，最终根据遗传距离将春兰、建兰、蕙兰、莲瓣兰聚为A类，墨兰、寒兰聚为B类，春剑为C类，兔耳兰为D类，多花兰、文山红柱兰、虎头兰等为E类，其中A、B、C在在传统分类学中均属建兰组，D类为兔耳兰组，E类除多花兰外均属大花组；季祥彪等(2008)采用272个RAPD标记发现贵州的12种兰属植物中，莲瓣兰(C. lianpan)及春剑与菅草兰(C. tortisepalum)高度同源，认为二者应为菅草兰的变种，现今分类学系统已将菅草兰合并到莲瓣兰中；吴振兴等(2008)也对兰属植物进行ISSR分析，表明16种植物中春兰和春剑亲缘关系最近，而与兔耳兰等其他兰属植物的亲缘较远。由此可见，分子标记聚类结果与形态学分类结果基本一致，并可作为一种更为细致的分类手段，从基因的水平对经典分类学进行适当的斧正。

不同种源地物种的亲缘关系分析也是分子标记的研究目的之一，Wang等(2009)通过ISSR遗传多样性研究将栽培春兰的50个品种分为两组——中国组和日本组，为春兰栽培品种种源分布及亲缘关系的确立提供了依据；白坚等(2012)采用SRAP技术对采自四川、台湾、广东的47个建兰品种进行分析，结果表明不同来源的建兰品种间遗传背景混乱，推测是因人工驯化导致这种现象的出现。分子标记技术还为兰属植物的分类及遗传多样性研究提供了一定的理论支撑。李丽辉等(2018)利用RAPD和ISSR分子标记技术，对7种国兰的21个品种资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，同样发现同种内亲缘关系更为相近；李璐滨等(2008)则从兰属植物菌根的多样性入手，利用AFLP技术分析、聚类显示，兰花的地理分布、所属种和生态类型是影响菌根真菌多样性与兰花专一性的关键因素。分子标记技术同时也可用于植物的后代鉴定，最近，袁媛等(2020)采用SRAP技术开辟了较可靠、联合鉴别建兰的3种引物——Me8-Em4、Me11-Em2和Me12-Em11，可用于建兰及其他兰属植物种质资源的鉴定。

此外，兰属植物基因组信息的缺乏会导致其分子标记的开发受限，为弥补这一缺陷，李小白等(2014)基于建兰的转录组测序数据进行SSR搜索，最终扩增出了61对引物，并在其中筛选出了39对有多态性的引物，这些引物还分别涉及GO、KOG和KEGG等途径的注释，并具有一定的通用性，为整个兰属的亲缘关系及群体结构分析提供了有力的支持。

4展望

综合来看，从染色体的倍性、核型、荧光原位杂交与最初的形态学分类结果关系不明显，而基于分子标记的遗传多样性分析则与传统分类基本吻合，部分种内亲缘关系还受到不同种源地等地理区位等方面的影响。目前国内对于兰属植物细胞学及分子细胞遗传学的研究进展虽相对国外研究较多，但总体研究仍不够全面，关于染色体的带型、染色体行为和荧光原位杂交技术几无报道，部分种、变种及种内的经典观赏品种也尚未研究到细胞方面。

分类学研究普遍认为，高等植物核型进化的基本趋势是从对称向不对称的方向发展的，以上结果显示，兰属植物主要是由中部着丝粒染色体(m)构成，核型多为2B型，即染色体大多是较对称的，在植物的系统演化进程中应当是处于相对较原始的状态。但是，从形态学性状来看，兰属植物的唇瓣、合蕊柱等高度特化器官的存在，使之被认为是被子植物中高级进化的种类。综合上述两个方面来看，兰属植物的细胞学和形态学进化方式与其他高等植物进化的方向存在一定的相悖性,由此可见，兰属乃至兰科整体的遗传进化研究及物种形成方面仍旧面临着极大的挑战。

作者贡献

徐子涵是本综述初稿写作的执行人；陈跃、胡凤荣是本研究章的构思者及负责人。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金青年基金(31801891)和江苏高校品牌专业建设工程(PPZY2015A063)共同资助。

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