Construction and Identification of luciferase Expression Vector yy621

Li Yujie ^1*　Nan Qiyan ^2*　Jin Meiyu ¹　Cao Hounan ¹　Yamamoto Y Yoshiharu ³　Zhao Chengri ^1**

1 Agricultural college, Yanbian University, Yanji, 133002; 2 Yanbian University Hospital, Yanji, 33000; 3 Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University, Yanagido 1-1, Gifu City, 5011193

* Li Yujie and Nan Qiyan contributed equally to this work

** Corresponding author, zhaochengri@ybu.edu.cn

Abstrac　The yy621 vector was constructed by adding a Bgl II restriction endonuclease site between the CaMV 35S minimal promoter sequence and the LUC gene sequence of vector yy449. The CaMV 35S minimal promoter sequence and the LUC gene were amplified by PCR, respectively. The primers should be designed to meet the following conditions: the upstream of the amplified fragment of the CaMV 35S minimal promoter sequence should include BamH I, and the downstream should include the Bgl II restriction endonuclease site; the upstream of the LUC gene sequence amplification fragment shall include Bgl II and downstream shall include the Xba I restriction endonuclease site. The two fragments were digested by Bgl II restriction endonuclease and then ligated to obtain the fragment containing the recognition site of Bgl II restriction enzyme between the CaMV 35s minimal promoter sequence and the LUC gene sequence, and digested with BamH I and Xba I restriction endonucleases, they were inserted between BamH I and Xba I sites of vector yy449 to replace the original CaMV 35s minimal promoter sequence and LUC gene sequence. Colony screening, PCR identification and sequencing confirmed that the recognition site of Bgl II restriction endonuclease was included between the CaMV 35S minimal promoter sequence and the LUC gene sequence in the positive colony, and the vector yy621 was successfully constructed. The luciferase expression vector yy621 constructed in this experiment is suitable for replacing the LUC gene with a resistance-related gene in the future, and determining the specific regulation of the synthetic promoter-related gene and the specific resistance of the plant to the adverse environment, or replace the CaMV 35S minimal promoter sequence (-46~ +1) with full-length promoter to observe the expression and regulation of LUC gene.

Keywords　Luciferase, yy621 vector, Construction

随着基因工程手段的不断发展，近年来世界的研究者们发现了很多与植物抗性相关的基因。如：酸性土壤中与Al³⁺毒和低pH抗(耐)性相关的ALMT1基因和STOP1、STOP2转录因子，与干燥胁迫的抗性相关的DREB家族基因等(Liu et al., 1998; Hoekenga et al., 2006; Iuchi et al., 2007; Kobayashi et al., 2014)。为了让植物获得特定的抗性，研究者们经常是将这些基因用基因工程手段导入到植物体中或者使其在植物体中过量表达，从而达到抗性育种的目的(Ortega-Amaro et al., 2014; Ding et al., 2015; Augustine et al., 2015)。但是，涉及到这些实验的很多研究者发现，抗(耐)性基因在植物体上过量表达后有时并不能得到预期的结果，反而会产生一些负面的效果(Liu et al., 1998; 余君涵等, 2016; 肖庆红等, 2018, 农业与技术, 38(09): 20-23)。应用基因工程的手段将特定的、与某种抗(耐)性相关的基因导入到一个正常的植物体后，此基因在转基因植物中会产生新的或者过量的蛋白质，影响植物体原有的代谢产物的平衡关系。如果导入的基因所产生的蛋白质对植物体的正常生长或者代谢不产生大的影响，植物体得到抗性性状之后也能保持正常或者接近于正常状态生长。相反，如果导入或过量表达的基因所产生的蛋白质对植物的正常代谢途径产生负面的影响时，转基因植物的生长是畸形的或者是不正常的(Liu et al., 1998; Mnaimneh et al., 2004; 崔百明, 2006)。那么，如何有效解决这些问题，是当前或者今后在抗(耐)性育种中亟待解决的一个崭新的课题。

为了让转基因植物只在遇到胁迫时适当表达那些已导入的特定的与抗(耐)性相关的基因，充分了解基因表达调控机理是至关重要的(Hirayama and Shinozaki, 2010)。最近的研究表明，在特定的时间、空间上有着相似表达变化规律的一些共表达基因群的启动子区域中有着相同或者类似的基因表达调控元件(Obayashi et al., 2007; 赵成日, 2017)。这种调控基因转录活性的要素在真核生物中叫做顺式调控元件。顺式调控元件是一类受到广泛关注的功能元素，它与转录因子结合并触发相应基因的表达是高等生物对生理环境改变的一种有效应答。因此，分析和识别转录因子、顺式调控元件，了解它们间的结合规律是理解和解释整个基因组行为的重要步骤(周强, 2008)。综合分析并挖掘不同胁迫应答中起重要作用的、组织特异表达的顺式调控元件后，利用分子生物学手段将这些调控元件整合到与某种抗(耐)性相关基因的启动子序列中，使其只在特定的条件下有效调控下游的抗(耐)性相关基因的空间表达。这样一来，可有效降低过量表达所导致的转基因植物的能量消耗，同时也有效降低已导入的与抗(耐)性相关基因所产生的多余的蛋白质对植物本身原有的代谢平衡的干扰，从而尽可能减少导入基因对植物正常生长发育的负面影响(崔百明, 2006)。

启动子是基因表达调控的“开关”。不同的启动子可以满足不同植物不同性能的需求，如rd29A启动子便是一种低温诱导型启动子，该启动子可以在低温条件下满足目的基因在转基因植物中进行表达(马琳, 2005)；在干旱条件下，蔗糖-1-果糖基转移酶基因，即，1-SST基因和根部特异性表达启动子pPST2a组合成的转pPST2a:1-SST基因甘蔗(Saccharum officinarum L.)植物与转rbcs:1-SST基因植株相比，前者植株抗旱性更好(武媛丽等, 2014)。已有成功的实验前例通过设计和合成包含5’非转录区的约2 000 bp的脱氧核糖核酸链，经过限制性内切酶KpnⅠ和Mlu I酶切后插入到pGL3-Basic载体中，形成的重组载体DNA测序结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子载体构建成功(王洪波等, 2012)。

让植物体随着人们的意愿只在给予一定的信号时适当表达那些已导入的特定基因，来满足植物正常生长的需求或人们的需求是合成生物学发展的目标。在植物启动子调控元件对下游基因表达机理研究中，表达载体的构建是非常重要的。荧光素酶表达载体的出现促进了基因功能分析的进程。然而，多数荧光素酶载体对于转基因植物的实体观察上表现并不如意。荧光素酶作为报告基因，其在植物中的表达远不如在动物体内的表达效果——易观察性。荧光素酶活性受到温度、酸碱度等多种因素的影响，环境中的某些有毒物质，还可和荧光素酶的活性部位或与其周围残基进行结合，使其催化的发光反应受到抑制进而增加观察难度(康洋, 2014)。

最近，Hayami等人用荧光素酶yy449载体成功分析了人工合成启动子序列对下游基因的表达调控。并用EM-CCD 相机实时拍摄转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物的荧光素强度的变化(Hayami et al., 2015)。说明yy449载体非常适合启动子调控元件序列对下游LUC基因的表达调控研究。然而，从yy449载体的结构上来看，因其在CaMV 35S minimal启动子序列(-46 ~ +1)和LUC报告基因之间没有酶切位点，导致无法单独替换启动子序列或者LUC基因。

本研究中，在载体yy449的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间增加Bgl II限制性内切酶位点，构建yy621载体。载体yy621的构建对于用抗性相关基因替换LUC基因，测定人工合成启动子对抗性相关基因的具体调控与赋予植物对不良环境的具体抗性表现，或者用全长启动子序列替换CaMV35 minimal启动子序列(-46 ~ +1)来观察LUC基因的表达调控具有重要的意义。

1结果与分析

1.1载体yy449的DNA提取

经电泳检测所得载体yy449的DNA大小在10 kb以上无降解(图1)。

图 1 琼脂糖凝胶电泳检测提取的yy449载体DNA 注: M: TaKaRa 1 kb DNA Ladder Marker; 1: 载体yy449 DNA Figure 1 Detection of extracted vector yy449 DNA by agarose gel electrophoresis Note: M: TaKaRa 1 kb DNA Ladder Marker; 1: Vector yy449 DNA

1.2载体yy449 DNA的酶切

为了确定yy449载体序列中实际存在的限制性内切酶的识别位点，我们用BamH I、Hind III、Bgl II、Xho I、Spe I、Sal I、Pst I、Nco I、EcoR V等9个限制性内切酶对yy449载体DNA进行了消化反应(图2)。

图 2 不同的限制性内切酶对yy449载体DNA的酶切效果 注: 载体yy449的DNA; 1: 利用限制性内切酶BamH I消化载体yy449的DNA; 2: 利用限制性内切酶Hind III消化载体yy449的DNA; 3: 利用限制性内切酶Bgl II消化载体yy449的DNA; 4: 利用限制性内切酶Xho I消化载体yy449的DNA; 5: 利用限制性内切酶Spe I消化载体yy449的DNA; 6: 利用限制性内切酶Sal I消化载体yy449的DNA; 7: 利用限制性内切酶Pst I消化载体yy449的DNA; 8: 利用限制性内切酶Nco I消化载体yy449的DNA; 9: 利用限制性内切酶EcoR V消化载体yy449的DNA Figure 2 The effect of different restriction enzymes on the enzyme digestion of yy449 vector DNA Note: P: Vector yy449 DNA; 1: Restriction enzyme BamH I digested the vector yy449 DNA; 2: Restriction enzyme Hind III digested the vector yy449 DNA; 3: Restriction enzyme Bgl II digested the vector yy449 DNA; 4: Restriction enzyme Xho I digested the vector yy449 DNA; 5: Restriction enzyme Spe I digested the vector yy449 DNA; 6: Restriction enzyme Sal I digested the vector yy449 DNA; 7: Restriction enzyme Pst I digested the vector yy449 DNA; 8: Restriction enzyme Nco I digested the vector yy449 DNA; 9: Restriction enzyme EcoR V digested the vector yy449 DNA

载体yy449的DNA序列中不存在Bgl II、Xho I、Spe I、Sal I、Pst I、Nco I、EcoR V等限制性内切酶的酶切位点(图2)。因此，可以作为yy449载体的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间新增限制性内切酶位点的后补。然而，限制性内切酶BamH I和Bgl II酶切后产生的粘性末端还可以在连接酶的作用下进行连接。新产生的连接部位序列不能再被限制性内切酶BamH I和Bgl II切开。这种特性对质粒载体的灵活运用有着重要的意义。

为此，我们决定在载体yy449的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间增加Bgl II限制性内切酶的识别位点(AGATCT)。

1.3 CaMV 35S minimal启动子序列的扩增与提纯

为了获得CaMV 35S minimal启动子序列，以yy449载体DNA为模板用CIP7_SacI_F和35S miniPro.(R)引物进行了PCR扩增。取3 µL的PCR产物在1%的TBE凝胶中电泳检测(图3中的1泳道)。利用试剂盒回收CaMV 35S minimal启动子序列，测定浓度，备用。

图 3 CaMV 35S minimal启动子序列和LUC基因序列的扩增产物电泳图 注: M1: TaKaRa 100 bp DNA Ladder Marker; M2: TaKaRa 1 kb DNA Ladder Marker; 1: 利用CIP7_SacI_F和35S miniPro.(R)引物扩增获得的CaMV 35S minimal启动子序列; 2: 利用Luc(+)Gene(F)和Luc(+)Gene(R)引物扩增获得的LUC基因片段 Figure 3 Electrophoresis of the amplification product of CaMV 35S minimal promoter sequence and LUC gene sequence Note: M1: TaKaRa 100 bp DNA Ladder Marker; M2: TaKaRa 1 kb DNA Ladder Marker; 1: CaMV 35S minimal promoter sequence amplified with CIP7_SacI_F and 35S miniPro.(R) primers; 2: LUC gene sequence amplified with Luc(+)Gene(F) and Luc(+)Gene(R) primers

1.4 LUC基因序列的扩增与提纯

为了获得LUC基因序列，以yy449载体DNA为模板用Luc(+) Gene(F)和Luc(+) Gene(R) 引物进行了PCR扩增。取3 µL的PCR产物在1 %的TBE凝胶中电泳检测(图3中的2泳道)。利用试剂盒回收LUC基因片段，测定浓度，备用。

1.5用Bgl II内切酶消化PCR产物及T₄ DNA连接酶连接

对CaMV 35S minimal启动子序列扩增片段和LUC基因序列扩增片段进行Bgl II单酶切反应。再经酶失活处理的两个片段用T₄ DNA连接酶进行连接。获得CaMV 35S minimal启动子序列和LUC基因序列之间包含一个Bgl II限制性内切酶识别位点的长片段连接产物。

1.6用BamH I和Xba I酶消化yy449载体DNA和长片段连接产物并连接

用BamH I和Xba I限制性内切酶分别双酶切yy449载体DNA及上述长片段连接产物，产生Vector和Insert。再用TaKaRa公司的DNA Ligation 试剂盒进行连接，获得重组载体。

1.7感受态细胞转化、菌落筛选及PCR鉴定

重组载体经感受态细胞转化、菌落筛选，获得了20个由单一菌株形成的阳性菌落，用于PCR鉴定，挑选4、5、9、10、13、17和20菌落进行测序鉴定(图4)。

图 4 用CIP7_SacI_F和Luc(+)Gene(R)引物对菌落1~20进行PCR鉴定 注: M: TaKaRa 1 kb DNA Ladder Marker; P: 载体yy449 DNA; 1~20: 菌落1~20 Figure 4 PCR identification of colony 1~20 by CIP7_SacI_F and Luc(+)Gene(R) primers Note: M: TaKaRa 1 kb DNA Ladder Marker; P: Vector yy449 DNA; 1~20: Colony 1~20

1.8用Bgl II和Xba I内切酶消化鉴定

挑选4、5、9、10、13、17和20菌落继续培养后，提取载体DNA。分别用Bgl II和Xba I限制性内切酶进行双酶切，鉴定。酶切产物在1.5 %的TBE琼脂糖凝胶上进行电泳(图5)。

图 5 Bgl II和Xba I双酶切鉴定新载体DNA 注: A: 载体DNA; B: 双酶切的载体DNA; M: TaKaRa 1 kb DNA Ladder Marker; P: 载体yy449 DNA; 4~20: 对应于菌落4~20的载体DNA Figure 5 Identification of new vector DNA by Bgl II and Xba I double digestion Note: A: Vector DNA; B: Double enzyme excised vector DNA; M: TaKaRa 1 kb DNA Ladder Marker; P: Vector yy449 DNA; 4~20: Vector DNA corresponding to colony 4~20

1.9测序鉴定

为了确定新构建载体序列的准确性，我们进行了测序。所使用的引物(表1)。

表 1 测序反应中使用的引物 Table 1 The primers used in sequencing

结果发现，菌落5号上的载体DNA序列是准确的。为此，我们将此载体命名为yy621(图6)。

图 6 载体yy449和yy621的比较 注: A: 载体yy449(1)和yy621(2)的结构图; B: 载体yy449和yy621的序列比较 Figure 6 The comparison of yy449 and yy621 vectors Note: A: Structure chart of yy449(1) and yy621(2) vectors; B: The sequence comparison of yy449 and yy621 vectors

2讨论

表达载体的出现为研究顺式调控元件对下游基因表达变化规律提供了便利工具。常用于表达载体的报告基因主要有GFP、GUS、LUC等。其中，LUC报告基因的敏感性、定量性远远超出其它报告基因(李强, 1995, 生物学杂志, (01): 12-13,10; 杨宇等, 2011)。这样一来，在实时观察人工合成启动子对LUC报告基因的调控作用时可以观察到其灵敏的动态调控图谱。而GFP和GUS报告基因由于半衰期较长会降低启动子对报告基因调控的灵敏性和检测率。

建立不同的表达载体研究不同生物应对不同环境变化的基因调控机理是人们有效利用庞大的基因资源的保障。最近，Hayami等人利用yy449载体在拟南芥植物体中成功分析了在UV-B、强光、冷胁迫处理下人工合成启动子序列对下游荧光素酶报告基因的动态表达变化(Hayami et al., 2015)。这无疑为拟南芥植物体上研究基因表达调控机理提供了很好的工具。然而，在不同胁迫处理(如偏酸溶液处理)时，此报告基因的信号表现出不稳定的现象(实验数据未公开)。为此，利用不同公司研发的LUC报告基因替换现有载体yy449中的LUC报告基因，建立崭新的表达载体，是解决上述问题的关键所在。为了方便替换载体yy449中的LUC表达基因建立崭新的、多种多样的表达载体，本研究中在CaMV 35S minimal启动子序列(-46 ~ +1)和LUC报告基因之间增加了一个Bgl II限制性内切酶识别位点。

在构建yy621载体的过程中发现每次酶切反应之前针对DNA进行一次乙醇沉淀可有效去除DNA溶液中多余的盐分，可保障限制性内切酶实验的顺利进行(罗立廷等, 2006)。在进行多条DNA片段进行连接时同时进行连接效果不佳，最好是逐一进行。并且，对插入片段(Insert)和载体(Vector)进行连接时 Insert/Vector的摩尔之比最好是保持在1以上，不过大于6时反而表现不佳。因此，建议使用3左右(李瑞国等, 2003)。

3材料与方法

3.1实验材料

载体yy449 (10578 bp, Genbank accession AB638628.1)由日本国立岐阜大学应用生物科学部植物分子生理学研究室的山本義治教授提供(https://www1.gifu-u.ac.jp/~yyy/map/yy449.pdf)。

3.2实验试剂

购自Promega公司的试剂主要有：载体DNA提取试剂Wizard^® Plus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒(Cat.# A1330)；凝胶及PCR产物纯化系统Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System；PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase (Cat.# R050A)；GoTaq^® Colorless Master Mix (Cat.# M7133)。购自TaKaRa公司的试剂主要有：DNA连接试剂DNA Ligation Kit (Cat.# 6023)；限制性内切酶BamH I、Hind III、Bgl II、Xho I、Spe I、Sal I、Pst I、Nco I、EcoR V、Xba I及反应缓冲液；E. coli DH5α Competent Cells (Cat.# 9057)。购自Thermo Fisher. Scientific公司的有：BigDye^® Terminator v3.1循环测序试剂盒。

3.3实验仪器

BIO-RAD T100^TM Thermal Cycler PCR扩增仪；夏日科技公司FR200-A型全自动紫外与可见分析装置；Biochrom NanoVue^TM Plus超微量分光光度计；艾本德公司的小型台式高速冷冻离心机(5417R)；湘仪公司微量台式高速离心机H1650-W型；北京君意东方电泳设备有限公司的JY600稳压稳流型电泳仪和JY-SPCT型电泳槽；Sangon Biotech公司的G500312EQU312型蓝光切胶仪。

3.4载体DNA提取及乙醇沉淀处理

保存在甘油中的含载体的大肠杆菌在含奇霉素(Spectinomycin, SP)和链霉素硫酸盐(Streptomycin sulfate salt, ST)的LB液体培养基中37°С条件下培养12 h。然后按照Promega公司的Wizard^® Plus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒说明书操作。所得载体DNA进行乙醇沉淀，去除多余的盐分，从而提高DNA纯度。具体如下：1加入DNA溶液的1/10体积的NaOAc溶液(3 mol/L, pH 5.2)于载体DNA溶液中充分混匀；2加入以上载体DNA溶液2.5倍体积的预冷100%乙醇(-30°С冷冻保存)；3用手混合至均匀；4~80°С处理15~20 min；5用手的热量溶解后，在4°С条件下14 000 rpm离心15 min；6 倒掉上清；7加入1 mL的70%乙醇(70%乙醇保存在4°С冷藏库)；8混匀离心管中的液体；914 000 rpm、4°С条件下离心10 min；10用移液器吸除上清。倒置10 min；11加入适量的1×TE使载体DNA溶解(本实验中加入50 µL)。

载体DNA和PCR产物的DNA浓度测定使用了Biochrom NanoVue^TM Plus超微量分光光度计。最终调制成100 ng/µL浓度(载体DNA)。

3.5限制性内切酶处理及酶失活处理

本试验中所使用的限制性内切酶及对应的酶切缓冲液均购自TaKaRa公司。酶切方法按照TaKaRa公司的限制性内切酶产品说明书进行。

为了防止酶切反应对后续实验的影响，每次使用限制性内切酶进行酶切反应之后对反应产物进行酶失活处理，具体如下：1加入与酶切反应体系等量体积的PCI溶液(苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，遮光冷藏保存，易氧化)，使酶失活；2用混匀器处理10 s后常温条件下14 000 rpm离心5 min；3用移液器将最上层液体转移到新1.5 mL离心管中(注: 共三层, 中间是蛋白质层)；4乙醇沉淀处理，浓缩DNA。

3.6 CaMV 35S minimal启动子序列的扩增

考虑到CaMV 35S minimal启动子序列扩增产物的下游序列中要包括Bgl II酶切位点，我们在设计下游引物时引物的3’端上增加了Bgl II限制性内切酶的识别位点序列(AGATCT)。具体如下：CIP7_SacI_F：5’-CGAGCTGGAGTTTTTTTCTG-3’(Tm=54.3ºC)；35S miniPro.(R)：5’-GTTTAGATCTGTTTAGTCCTCTCCAAATGAAATGA -3’(Tm=55.6ºC)，PCR产物大小应为170 bp。反应体系，如下：Vector DNA (100 ng/µL) 1 µL、CIP7_SacI_F primer (10 pmol/L) 1 µL、35S miniPro.(R) primer (10 pmol/L) 1 µL、5×PrimeSTAR^® GXL Buffer 10 µL、dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 µL、PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase (1.25 U/µL) 1 µL、H₂O 32 µL，共50 µL。PCR条件，如下：94°С 15 s、80°С 1 min、30循环(98°С 10 s、53°С 15 s、68°С 30 s)、68°С 5 min、16°С ever。

3.7 LUC基因序列的扩增

考虑到LUC基因序列扩增产物的上游序列中要包括Bgl II酶切位点，我们在设计下游引物时引物的5’端上增加了Bgl II限制性内切酶的识别位点(AGATCT)。具体如下：Luc(+)Gene(F) ：5’-AAACAGATCTAAACAATGGCTATGGCTGAAGACGC-3’(Tm=60.5ºC)；Luc(+)Gene(R) ：5’-AACGATCGGGGAAATTCGATCGAAT-3’ (Tm=58.8ºC)，PCR产物大小应为1 711 bp。反应体系，如下：Vector DNA(100 ng/µL) 1 µL、Luc(+)Gene(F) primer (10 pmol/L) 1 µL、Luc(+)Gene(R) primer (10 pmol/L) 1 µL、5×PrimeSTAR^® GXL Buffer 10 µL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 µL、PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase (1.25 U/µL) 1 µL、H₂O 32 µL，共50 µL。PCR条件，如下：94°С 15 s、80°С 1 min、30循环(98°С 10 s、60°С 15 s、68°С 2 min)、68°С 5 min、16°С ever。

3.8 PCR产物的凝胶回收

本研究中PCR扩增产物的凝胶回收利用Promega公司的Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒。

3.9酶切反应及酶失活处理

Bgl II单酶切反应：Bgl II restriction enzyme (1U/µL) 1.0 µL、10×H Buffer 2.0 µL、PCR product ≤1.0 µg、H₂O Up to 20.0 µL，共20.0 µL。在0.2 mL离心管中充分混匀后在37°С处理3 h后，在70°С处理20 min。进一步进行酶失活处理。

BamH I和Xba I双酶切反应： 10×K Buffer 2.5 µL、PCR product (or Vector yy449 DNA) ≤1.0 µg、BamH I restriction enzyme (1U/µL) 2.5 µL、Xba I restriction enzyme (1U/µL) 2.5 µL、H₂O Up to 50 µL，共50.0 µL。在0.2 mL离心管中充分混匀后在37°С处理3 h后，在70°С处理20 min。进一步进行酶失活处理。

Bgl II和Xba I双酶切反应：10×K Buffer (2×T) 4 µL、Vector DNA (100 ng/µL) 10 µL、Bgl II restriction enzyme (1U/µL) 1 µL、Xba I restriction enzyme (1U/µL) 1 µL、H₂O 4 µL，共20 µL。在0.2 mL离心管中充分混匀后在37°С处理3 h后，在70°С处理20 min。

3.10T₄ DNA连接酶反应

本试验中使用了TaKaRa公司的DNA Ligation (Cat.# 6023)试剂盒。

3.11感受态细胞转化

E. coli DH5α Competent Cells (Cat.# 9057)购自TaKaRa公司。T₄ DNA连接酶反应产物的转化按照感受态细胞产品说明书操作完成。

3.12菌落的筛选及PCR鉴定

将转化反应溶液中取出100 µL均匀涂布在含SP和ST(终浓度20 mg/L Amp)抗生素的LB培养基平板上。37°С条件下静置培养12 h后，观察菌落形成情况。从中选出20个由单一菌株形成的菌落进行PCR鉴定并转移到新的LB培养基平板上(含SP和ST抗生素)，继续培养。

PCR鉴定上我们使用了CIP7_SacI_F和Luc(+)Gene(R)引物组合对上述的20个菌落DNA进行了PCR扩增。反应体系，如下：菌落(DNA) -(1 µL)、CIP7_SacI_F primer (10 pmol/L) 1 µL、Luc(+)Gene(R) primer (10 pmol/L) 1 µL、GoTaq^® Master Mix (Promega, 2×) 10 µL、H₂O 8 µL，共20.0 µL。PCR条件，如下：94°С 15 s、80°С 1 min、30循环(94°С 15 s、54°С 30 s、72°С 2 min)、72°С 5 min、16°С ever。

3.13电泳

本实验中使用0.5×TBE电泳缓冲液，在1.0~1.5%琼脂糖凝胶，50 V恒电压下电泳2~3 h。最后用EtBr或SYBR Green工作液染色30 min，利用凝胶成像设备照相。

作者贡献

李玉洁、南奇延是本研究的实验设计和实验研究的执行人；赵成日、李玉洁和南奇延完成数据分析，论文初稿的写作；金美玉、曹后男和山本義治参与实验设计，试验结果分析；赵成日是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(31660319)和吉林省科技发展计划项目(20200402088NC)共同资助。

参考文献

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