洋葱(Allium cepa L.)又名球葱、圆葱、玉葱，属于百合科葱属（Allium）二年生植物，世界上重要的蔬菜之一，是中国主要栽培和出口的蔬菜之一(Hou et al., 1997)。在全世界中，洋葱的种植面积仅次于马铃薯和番茄，富含多种硫化物和糖类。具有降低和预防血栓的形成，抗动脉硬化、降血脂、降血压、预防心肌梗塞的作用，广泛应用于食品、医药和保健等领域，随着进一步深入研究，洋葱已经成为一种越来越重要的植物资源(刘冰江等, 2007;陈沁滨等, 2007)。

我国洋葱种质资源主要依赖于国外进口，存在种质资源的遗传背景不清楚。本研究采用SSR分子标记技术，对国家蔬菜工程技术研究中心所保存的63份洋葱种质资源进行遗传多样性分析，判断其不同品种之间的亲缘关系，以期为洋葱分子标记辅助育种及其起源与演化研究提供科学依据，为种质资源的筛选、保存、开发、利用提供有利基础。

1结果与分析
1.1洋葱基因组DNA的提取
用改良的CTAB法提取基因组DNA，所得DNA含量较高，质量较好，比较完整，符合SSR-PCR扩增反应的要求(图1)。

图1  部分洋葱品种的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果 注: M: DNA marker D15000; 1~18号依次是编号1~18号洋葱品种 Figure 1 Parts test results of genomic DNA of onion use Agarose gel electrophoresis Note: M: DNA marker D15000; No.1~18 is Followed by No. 1~18 onion varieties

1.2引物的筛选与PCR扩增结果
对40对洋葱引物进行多态性分析，获得8对多态性丰富、扩增谱带清晰的引物(表1)，总共获得50条条带，其中有27条清晰、重复性高的多态性条带(等位变异)，多态性条带百分率为54%，差异条带的分子量范围为300～700 bp。

表1 多态性SSR洋葱引物序列 Table 2 Sequences of the polymorphic SSR onion primer

1.3遗传多态性分析
依据SSR鉴定数据，计算出各引物遗传多样性参数(表2)。8对引物的平均多态性信息量(PIC)为0.4973，变化范围为0.2254~0.6987，ACE044引物最低，ACE 111引物最高(图2)，表明引物ACE 111的遗传多样性较丰富，引物ACE 044的遗传多样性较窄。
 

图2 引物ACE 111在部分洋葱品种的扩增条带 注: M: Trans DNA marker I; 1~46: 1~46编号洋葱品种 Figure 2 The PCR amplification products in parts of onion varieties with primers ACE 111 Note: M: Trans DNA marker I; 1~46: No.1~46 onion varieties

表2 63份洋葱材料基于8对SSR引物的遗传多样性分析 Table 3 Analysis of genetic diversity for 63 onion accessions using 8 SSR primer pairs

8对引物的等位变异数(NA)变幅为2~5条，平均3.125条；有效等位变异数(NE)范围为1.2119~3.8614，平均为2.4068。Shannon信息指数(I)变幅为0.3179~1.3709，平均为0.9041；观察杂合度(Ho)变幅为0.0847~0.7903，平均为0.4401，反映杂合位点在基因组中所占比例高；期望杂合度(He)的变化幅度为0.1762~0.7470，平均为0.5243。结果表明洋葱试材的普遍存在杂交，杂交率较高。Nei's基因多样性指数(H)的变化幅度为0.1748~0.7410，平均为 0.5200。表明所选引物扩增的多态性存在较大的差异，遗传多样性丰富。

1.4聚类分析
基于遗传相似系数，利用UPGMA法对试验材料进行聚类分析(图3)，结果表明，种质资源在遗传相似系数0.65为阈值时聚为两大类5个组群。A类中的A1和A2分别为中日照早熟品种和短日照品种。B类中的B 11组包括24份种质资源，5份国内品种，剩余19份为国外品种，其中11份美洲品种，6份欧洲品种,日本和澳大利亚各1份；B12组包括13份种质资源，主要是Spanish的长日照品种，编号62、63的两个洋葱品种的遗传相似系数都达到了1.00，说明这两个品种的亲缘关系很近，或者两份样品可能就是同一品种；B2组包含8份种质资源，为中日照晚熟品种，5份国内品种，其它为国外品种；结果显示63份洋葱品种可分为两大类，其中短日照洋葱与部分中日照早熟洋葱品种聚一大类，长日照与部分中日照晚熟洋葱品种另聚一大类，而在长日照类型中Yellow Globe Danvers耐贮性品种聚为一个类群，Spanish长日照类型品种聚为一个类群；就品种的外皮颜色而言，每一类里都有紫皮、红皮、黄皮或白皮品种。上述结果与生态学的分类相一致，表明了中日照类型洋葱起源分化的复杂性，同时较好的揭示了洋葱种质资源遗传多样性与种内亲缘关系，为遗传育种和选择杂交亲本提供科学依据。

图3 63份洋葱品种SSR统计结果聚类图 Figure 3 The tree plot of clustering analysis on SSR result of 63 onion varieties accessions

2讨论
关于洋葱的种质资源遗传多样性研究已有报道，研究方法一般有形态学鉴定(D'ennequin et al., 1997)、细胞学鉴定(Ricroeh et al., 1992)、生化学鉴定(Peffley et al., 1987;Rouamba et al., 1993; Bradeen et al., 1995; Bark et al., 1995)、分子鉴定(Sangeeta et al., 2006)等。Kutty 等用RAPD 标记评价了24个短日照洋葱的遗传多样性(Kutty et al., 2006)；崔成日等用RAPD技术对41份长日照洋葱的种质资源的遗传多样性进行了分析(Cui et al., 2006)；徐启江等应用4条扩增产物条带清晰、多态性高的ISSR引物对32份长日照洋葱种质资源的遗传多样性进行了分析，共扩增出39条带，其中31条带为多态性位点，多态性条带比率(PPB)为79.48%，为洋葱遗传育种和杂交选择提供科学依据(徐启江等, 2007)。Fischer等利用30个STMs位点对83个洋葱品种进行遗传多样性分析，发现一些多态性位点可用来区分亲缘关系很近的品种，认为SSR是进行品种基因型鉴定和分析种内关系的有效工具(Fischer et al., 2000)。上述以往的研究多集中在仅对洋葱的短、中、长日照三个类群中的一个类群进行分析，而本研究同时对包括三个类群中的63份洋葱材料进行分子聚类分析，更好的揭示了洋葱种质资源遗传多样性。

3材料和方法
3.1试验材料
本试验研究的63份洋葱种质资源,其中30份种植于国家蔬菜工程技术研究中心农场大棚，采取洋葱嫩叶，其余洋葱品种直接采用种子作为试材，均由国家蔬菜工程技术研究中心提供(表3)。

表3 63份供试洋葱品种 注: 长日照, 中日照, 短日照; 早熟, 中熟, 晚熟 Table 1 63 of onion varieties in this study Note: LD, ID, SD; EM, IM, LM

3.2基因组DNA的提取
采用改良的CTAB法(王永勤等, 2010)进行试材基因组DNA的提取，利用分光光度计及琼脂糖凝胶电泳法进行DNA浓度和纯度检测。

3.3引物筛选与PCR扩增
以9个形态差异显著的洋葱样品DNA为模板对40对洋葱SSR引物进行筛选，引物由北京奥科生物技术有限公司合成。PCR扩增体系是为20 µL，包含30 ng DNA模板、200 µmol/L dNTP、1.5 µmol/L引物、1.5 mmol/L Mg²⁺、0.3 U Taq DNA聚合酶，补水到20 µL。PCR反应程序：94℃预变性2.0 min；94℃变性0.5 min；62℃~50℃(-1℃/1个循环)退火0.5 min；72℃延伸0.5 min,12个循环；94℃变性0.5 min；55℃退火0.5 min；72℃延伸0.5 min，22个循环；72℃延伸4.0 min；最后4℃保存。

3.4电泳与银染检测
PCR扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，ddH₂O快速清洗2次，0.2% 硝酸银染色12 min，ddH₂O再清洗2次，显影液1.5% NaOH，1%甲醛溶液显色。电泳缓冲液为1×TBE，电压70V，电泳1.5~2.0 h。

3.5数据统计分析
SSR扩增以0、1、9统计建立数据库，在相同迁移位置上，有带记为“1”，无带或带极弱记为“0”，缺失记为“9”，得到原始数据。应用Popgene Ver.1.32软件计算参试资源的等位基因数(NA)、有效等位基因数(NE)、Shannon-Weaver信息指数(I)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Nei's基因多样性指数(H)等参数。用PIC-CALC分析多态性信息量PIC。采用非加权平均法(UPGMA)进行聚类分析，得到遗传相似系数，并建立聚类图。统计数据在NTSYS-pc Ver.2.10e软件下处理。

作者贡献
关绚丽、田保华完成数据分析，论文初稿的写作；梁毅、王永勤是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家公益性行业科技“葱姜蒜产业发展关键技术研究与开发”(20093018)、北京市常规育种财政专项“蔬菜种质资源的收集保存和评价利用”(2009-509)和北京农林科学院青年科研基金项目“洋葱异源细胞质雄性不育系快速转育技术及育种应用研究”(BAAFS200901)共同资助。感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。本文中提到了我们实验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商，这并非我们为这些试剂供应商和测序服务商的产品和服务提供推荐或背书。

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