Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the R2R3-MYB Genes Family in Rosa chinensis

Li Mouliang　Zhang Xiaoni　Lin Shengnan　Wu Quanshu　Bao Manzhu　Fu Xiaopeng ^*

College of Horticulture and Forestry Sciences, Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070

*Corresponding author, fuxiaopeng@mail.hzau.edu.cn

Abstract　Rosa chinensis is a commercially important ornamental plant cultivated worldwide with high ornamental and economic value. The objectives of this study were to analyze the structure, conserved domain and evolution of R2R3-MYB by bioinformatics, besides, it was also to study the expression specificity of family members in different tissues and investigate the biological function of R2R3-MYB genes family in Rosa chinensis. According to the reported R2R3-MYB genes of Arabidopsis thaliana, one hundred and twenty members of R2R3-MYB genes in Rosa chinensis ‘Old blush’ were identified by BLAST and Hmmer tool. Phylogenetic tree indicated that these genes were divided into 34 subgroups. The N-terminal of the amino acid sequence of R2R3-MYB family members contains 2 unequal repeat domains R2 and R3. The results of gene structure analysis showed that the R2R3-MYB family genes contain 1 to 11 exons; 120 genes were located on 7 chromosomes of rose, and 8 tandem repeat events occurred by chromosome mapping anaylsis. The results of analysis of genome correlation, a total of 16 pairs of R2R3-MYB gene clusters were found. Based on the analysis of gene expression patterns, the results showed that 120 genes were wildly expressed throughout the development of the rose. What’s more, they could be divided into 6 subgroups, and there were different patterns of expression between each subgroup.

Keywords　Rosa chinensis, R2R3-MYB genes family, Bioinformatics, Expression model

月季作为世界四大切花之一，具有重要的观赏价值和经济价值，其中，花色作为月季重要的观赏性状之一，具有十分重要的研究意义；而花色主要受到MYB转录因子的调控。MYB基因家族广泛存在于真核细胞中，也是植物中最大的基因家族之一(Dubos et al., 2010)。MYB基因家族在序列N端附近存在着高度保守的DNA结合结构域，该结构域由1-4个不完全重复序列串联，每一个重复序列包含52个左右的氨基酸残基，第二个重复序列和第三个重复序列构成螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)的结构，包含3个色氨酸，同时被18-19个氨基酸残基间隔开，形成一个可以与靶基因相互作用的二级结构；而在序列的C端，存在着差异性较大的保守结构域，使得MYB基因家族有着不同的调节功能。MYB基因可以根据不完全重复序列的数目，可将MYB基因划分为四个不同的类型，根据不完全重复序列的数目可以划分为2R (R2R3-MYB)，3R (R1R2R3-MYB)，4R (R1R2R2R1/2-MYB)和1R-MYB (MYB-related proteins)，其中R2R3-MYB基因占比较多(Ma and Constabel, 2019)。

R2R3-MYB是MYB家族的主要类型，作用于植物的次生代谢，包括苯类，苯丙烷，萜类和芥子油苷等途径(张刚等, 2017)。在影响花青素和原花青素(PAs)代谢途径中(刘晓芬等, 2013)，与花青苷合成相关的激活转录因子，如拟南芥中的AtMYB75 (PAP1)，AtMYB90 (PAP2)，AtMYB113和AtMYB114可以调控花青苷的积累(Gonzalez et al., 2009)，在葡萄中的VvMYBA1和VvMYBA2 (Walker et al., 2007)，苹果中的MdMYB10和MdMYB110a也发现相似结果(Chagne et al., 2013)，而与原花青素(PAs)合成相关的激活转录因子，如拟南芥中的AtMYB123 (TT2)和AtMYB5 (PA1) (Schaart et al., 2013)，葡萄中的VvMYBPA1，VvMYBPA2，VvMYB5a和VvMYBPAR (Koyama et al., 2014)，桃中的PpMYBPA1和PpMYB7 (Zhou et al., 2015a)以及苹果中的MdMYB9和MdMYB11 (An et al., 2015)都可以作用于植物体内原花青素的合成；不仅如此，R2R3-MYB也可以对生物和非生物胁迫进行响应，在玫瑰(Rosa rugosa)中，外界胁迫如伤口和氧化可以诱导PA1-型和TT2-型R2R3-MYB转录因子RrMYB5和RrMYB10的高表达响应，从而促进类黄酮结构基因的表达，花青素和原花青素的合成进而增强了植物对创伤和氧化胁迫的耐受性(Shen et al., 2019)，光照能激活血橙(Citrus sinensis)中HY5基因与R2R3-MYB基因CsRuby1启动子区域G-box响应元件结合激活其表达(Huang et al., 2019)，从而使果肉颜色由白色变为紫红色；此外，有研究报道植物中一些奇特的花型也与R2R3-MYB基因有关，牡丹(Paeonia suffruticosa)花心斑的形成是由于R2R3-MYB基因PsMYB12能特异的在心斑处激活PsCHS基因的表达从而导致心斑处花青素的积累形成心斑类型的花朵(Gu et al., 2019)。R2R3-MYB基因一直是植物色泽研究的热点，但月季中R2R3-MYB基因家族的全面鉴定和分析鲜有报道；月季基因组的发表(Raymond et al., 2018)，极大促进月季重要性状的研究，为全面鉴定R2R3-MYB基因家族奠定了基础。本研究基于月季基因组对月季R2R3-MYB基因家族进行鉴定，并对这些基因的结构、保守域和组织特异表达进行了研究，并根据月季‘Old Blush’转录组数据，对月季R2R3-MYB基因表达模式进行分析，为今后解析R2R3-MYB参与月季生长发育的作用机制，培育月季新品种提供理论依据。

1结果与分析

1.1月季R2R3-MYB基因家族分析

为研究月季R2R3-MYB家族基因结构以及系统进化关系，利用BLAST和Hmmer进行搜索，结合Pfam和SMART分析除去不含有MYB-结构域或者读码区不完整的序列，最终共得到120个R2R3-MYB基因。分析发现，这些基因都在序列的N端具有两个MYB保守结构域。将这120个R2R3-MYB基因与拟南芥R2R3-MYB基因进行聚类分析，发现月季R2R3-MYB基因共分为34个亚组(图1)，其中有39种蛋白质序列无法聚集。利用MEME软件分析月季R2R3-MYB家族基因编码蛋白的保守基序后，共鉴定出20个保守基序(图2)，在序列的N端每一条蛋白质序列均含有motif-1、motif-2、motif-3，这三个基序中皆存在保守色氨酸残基，与R2，R3结构域相关；而在序列的C端保守原件差异较大，亚家族S4、S9、S10、S11、S24中，存在motif-5，属于C2结构盒(EAR motif)，是具有负调控能力的保守域；motif-11至motif-17为未知盒，主要集中在S21、S24、S25、S26亚家族中。

图 1 利用月季和拟南芥R2R3-MYB蛋白构建的系统发育树 Figure 1 The phylogenetic tree analysis of R2R3-MYB family proteins in Rosa chinensis and Arabidopsis thaliana

图 2 月季R2R3-MYB家族基因保守元件预测  注: A: 保守原件分布图; B: 20个motif的详细结构 Figure 1 Conserved element prediction of R2R3-MYB family genes in Rosa chinensis Note: A: The conservative element distribution figure; B: The detailed structure of 20 motifs

1.2月季R2R3-MYB基因保守结构域分析

对鉴定出的120条月季R2R3-MYB序列进行MUSCLE多重比对，并用G-block进行修剪，共鉴定出高度保守的103个氨基酸。这些氨基酸序列N端均形成两个特殊结构域R2-和R3- (图3)，分别由51个和52个氨基酸残基组成。每个结构域都形成三个螺旋，被在其中周期性出现的色氨酸残基(W, Trp)所间隔，形成HTH结构，它被作为MYB结构域的标志。对两个结构域进一步分析发现，R3-中的第一个色氨酸大多数会被疏水性氨基酸代替，除此之外，在结构域R2-中，E (Glu)-8、D (Asp)-9、R (Arg)-3543、N (Asn)-46、L (Leu)-48在R2-和R3-连接处；结构域R3-中，E (Glu)-10、G (Gly)-22、R (Arg)-35、T (Thr)-36、K (Lys)-41，这些位点在月季R2R3-MYB基因家族中高度保守；在三个螺旋结构中，第三个螺旋明显比另外两个螺旋结构更加保守。在月季R2R3-MYB中这些结构特征与前人研究结果类似(Kaneiishii et al., 1990)。

图 3 月季R2R3-MYB基因R2 (A), R3(B)保守域 Figure 3 Sequence logos of the R2 (A) and R3 (B) MYB repeats for the full-length alignments of all rose R2R3-MYB domains

1.3基因结构和染色体定位分析

分析120条月季R2R3-MYB家族基因在月季七条染色体上的位置(图4)，发现大部分家族基因分布在染色体的上下臂。基因在1号、3号、4号、5号上分布较少，主要集中在2号、6号和7号染色体上，且这三条染色体上共发生8次串联重复事件；利用在线软件GSDS对月季R2R3-MYB家族基因进行结构分析(图5)，结果显示月季R2R3-MYB基因家族内含子和外显子数目存在高度的差异性，内含子数目是0到10，外显子数目是1到11。其中S1、S9、S12亚组的基因结构一致性较高，S21、S25、S26亚族差异性极高，分化严重。

图 4 月季R2R3-MYB基因的结构分析 注: 黄色代表CDS区域; 蓝色代表基因上下游5’和3’区域; 横线代表内含子 Figure 4 Gene structure of R2R3-MYB genes in Rosa chinensis Note: Yellow lines indicate the CDS of genes; Blue lines indicate the upstream/downstream; Gray lines indicate intron

图 5 月季R2R3-MYB基因的染色体定位 注: 基因名的颜色代表着不同亚组, 红线代表着串联重复 Figure 5 Chromosome location of R2R3-MYB genes in Rosa chinensis Note: Gene name colors indicate different subgroups, and red lines indicate tandem repeats

1.4相关性分析以及物种进化分析

对120条月季R2R3-MYB家族基因相关性进行分析，发现在7条染色体上共有16个重复基因的R2R3-MYB基因簇(图6A)，其中大部分集中在2号染色体上。与拟南芥和草莓基因组相比(图6B)，月季R2R3-MYB家族基因在染色体上位置变异度高。月季与草莓基因组相似度极高，月季R2R3-MYB家族基因分布与草莓也很类似；月季1、2、3号染色体上的基因大多对应草莓5、6、7号染色体上(图6B)。

图 6 月季R2R3-MYB基因共线性分析 注: A: 月季基因组内部共线性圈图, 灰线代表基因在染色体上的位置, 弧线表示基因之间的共线性关系, MYB基因对用红线突出, 基因名颜色代表不同亚组; B: 月季, 拟南芥和草莓基因组间共线性分析, MYB基因对用黄线突出 Figure 6 Synteny analysis of R2R3-MYB genes Note: A: Synteny analysis of R2R3-MYB genes in Rose, gray lines mark the position of genes on chromosomes, curved lines indicate collinearity relationship among genes, whereas the red lines suggest duplicated MYB gene pairs, gene name colors indicate different subgroups; B: Synteny analysis of R2R3-MYB genes between rose as well as Arabidopsis and strawberry, the yellow lines suggest duplicated MYB gene pairs

1.5月季R2R3-MYB家族基因表达分析

基于月季‘Old Blush’不同部位和不同时期的RNA-Seq数据库，分析月季R2R3-MYB家族基因在表达模式。选取月季R2R3-MYB家族基因在13个不同时期和部位(未开的花BFL, 开放的花OFT, 衰老的花SEN、休眠腋芽NDB, 白色幼根RAC, 活跃的腋芽DBO, 幼叶和茎FTN, 花分生组织的早期花期官IMO, 分生组织转变时期的花蕾IFL, 刚成熟果实CYN, 水分胁迫的叶片FTS, 产生微孢子和微配子的雄蕊DET, 灰葡萄孢菌LR18感染的叶片FTB)，依据基因的表达，将120条R2R3-MYB家族基因分为6组(图7)。其中Ⅰ组包含24个基因，在不同的组织和时期皆有表达，推测这些基因参与植物的整个生长发育过程，其中S9亚家族基因Chr2g174081和S6亚家族基因Chr3g0448721在BFL，OFL花朵转色时期显著表达，Chr3g0448721作为RhMYB10的同源基因，推测其具有促进花青素合成的功能；在Ⅱ组中包含26条基因，主要集中在在NDB、DBO、IMO、DET以及花朵发育时期表达，相较于Ⅰ组，其表达具有一定特异性，集中于腋芽，花器官等部位；在Ⅲ组中有18条基因，其中在IMO和FTS表达量显著增多，推测主要与植物分生组织相关；在Ⅳ组中有28条基因，在大部分的组织和部位中表达量较低，可能不参与植物生长发育；在Ⅴ组中有15条基因，其中大部分基因都集中在NDB、FTN、IMO、CYN、DET表达，表明这些基因与植物腋芽和花发育早期幼嫩组织形成有关，除此之外Chr3g0458721、Chr7g0234171在RAC中特异表达显著，说明这些基因还可能参与植物组织幼根的发育；在Ⅵ组中存在6条基因，其组织特异性表达水平不高，在13个时期组织普遍存在表达，其中，S14亚家族基因Chr6g0310351在幼根中表达量较高，推测功能与根部发育相关，与Ⅰ组不同的是，Ⅵ组中的基因在不同组织和时期中表达量更高，推测Ⅵ组基因具有更加广泛性的功能，对于植物组织(根, 茎, 叶, 花)正常生长发育具有更重要的作用。

图 7 月季R2R3-MYB基因在月季‘Old Blush’中的表达热图 注: 基因名颜色代表不同亚组, 用罗马数字标出, 共有6个; 蓝色到红色代表13个不同时期和部位的相对表达数据 Figure 7 The heatmap of expression of RcR2R3-MYB family genes in Rosa chinensis ‘Old Blush’ Note: Gene name colors indicate different 6 subgroups with Roman numerals; The colors that is blue to red indicate relative expression data of 13 different periods and tissues

2讨论

R2R3-MYB家族是一类具有R2和R3结构域的基因家族，其所编码的蛋白普遍参与调控花色、果色或响应胁迫(朱婷婷等, 2016)。为全面了解月季中的R2R3-MYB家族基因，本研究基于月季基因组数据的公布，鉴定出120条月季R2R3-MYB基因。利用聚类分析构建了月季R2R3-MYB家族系统进化树，月季120条基因共分为34个亚组。由于R2R3-MYB基因的保守性，具有相似或者相同功能的基因会归为同一亚组，这为研究该基因家族相关基因的功能提供了可靠的依据。在拟南芥S6亚组中，AtMYB75 (PAP1)、AtMYB90 (PAP2)、AtMYB113和AtMYB114是调控拟南芥花色苷生物合成的主要转录因子，Chr3g0448721、Chr7g0235271、Chr2g0116071、Chr3g0492711、Chr2g0116041与它们聚为同一支，推测它们之间的功能存在相似性，可能对月季花色苷调控存在重要功能。拟南芥S4亚组中，AtMYB4能够抑制苯丙氨酸途径C4H基因的表达(Zhou et al., 2015b)，推测与其遗传距离接近的Chr7g0178691、Chr4g0441081、Chr7g0178681、Chr6g0252211、Chr7g0228621也具有相似功能(Dubos et al., 2010)。拟南芥S14、S16、S19、S21、S22亚组对于植物营养和生殖生长发育都具有重要功能，另外，在S1亚组中，AtMYB30、AtMYB60和AtMYB96能够激活响应胁迫的转录因子，对于植物体逆境生长具有重要作用(Dubos et al., 2010)，推测Chr3g0495721、Chr7g0181361、Chr2g0168581也能响应胁迫条件。R2R3-MYB基因广泛参与植物生长发育过程，了解这些基因的结构和功能，对于今后月季育种以及生命科学研究具有重要意义。

月季R2R3-MYB基因N端结构存在高度保守性，而在序列C端特异性较强，这可能是基因功能分化的原因(段童瑶等, 2020)。通过对月季120条R2R3-MYB基因氨基酸比对以及MEME分析，发现在序列的N端存在两个高度保守的不等重复结构域R2和R3，与目的基因DNA直接作用，此处若发生突变会造成基因功能丧失，R3重复序列中存在保守的[DE]Lx2[RK]x3Lx6x3R残基，这些残基对于与bHLH转录因子的相互作用至关重要，这也是MYB转录因子调节花青素和PA的主要途径(Xu et al., 2015)；而在序列的C端，保守域则展现出较大的差异性，大部分的阻遏型转录因子C端会存在C1-motif (GIPD-motif)、C2-motif (EAR-motif)、TLLLFR motif，C1-motif、C2-motif已被证实具有阻遏作用，而TLLLFR motif作用尚不明确(Ma and Constabel, 2019)。在拟南芥S9、S11亚家族具有C1-motif，S4亚家族中具有EAR-motif，保守结构域是LxLxL，同样的发现月季S4、S9、S11亚组的16个基因也具有相似保守结构，推测这些基因对植物生长发育具有阻遏作用；而其他基因并没有这样的结构，这些结构可能是使基因功能分化的原因之一。

月季R2R3-MYB基因家族成员在不同的时期和不同组织部位中表达模式不同。Ⅰ组基因在各组织部位和发育时期皆有表达，在植物生长发育阶段具有重要作用，而Ⅵ组基因表达更为强烈，可能是参与调控植物生长发育的主效基因，Ⅱ组的基因在IMO、BFL、OFT、SEN花色发育的不同时期显示出相同的表达模式，其中在开花期OFL表达量最高，而在苹果中MdMYB10和MdMYB110a会随着果皮颜色加深而大量表达(Chagne et al., 2013)，推测Ⅱ组的基因与开花过程以及花色色素合成存在一定联系，；而Ⅲ组和Ⅳ组基因在不同的组织和时期表达量较低，甚至不表达，可能不参与植物生长发育；各组之间的基因表达模式存在较大差异性，暗示R2R3-MYB不同组之间在植物发育过程中扮演不同角色。此外，月季R2R3-MYB基因在染色体上普遍成簇分布，主要集中在2、6、7号染色体的上下臂，并发现有基因复制现象，通过对重复基因以及基因表达数据分析发现，重复基因对Chr1g0369061-Chr3g0464251、Chr4g0392981-Chr6g0288151、Chr1g0360311-Chr7g0186441、Chr2g0106671-Chr6g0308731、Chr2g0167441-Chr7g0181801具有相同的表达模式，其表达主要集中在花朵发育过程中，推测他们共同参与月季的花发育，其他重复的MYB基因表达模式的差异，反映了重复基因的亚功能或新功能。

3材料与方法

3.1月季R2R3-MYB基因序列筛选

本研究使用的月季基因组和蛋白质序列均下载于Rosa chinensis ‘Old Blush’基因组网站(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr// pub/RchiOBHm-V2/)。从前人文献中以及NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得已鉴定的拟南芥R2R3-MYB基因家族共计126个基因的蛋白质序列，利用BLASTP (E<10^-7)在月季蛋白质数据库进行比对搜索，并去除重复序列。在Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)下载所有物种的MYB结构域序列(PF00249)，然后采用HMMER 3.0软件(http://hmmer.org/)再次进行比对搜索，参数设置为默认参数。将两次搜索得到的序列取交集，利用Pfam和SMART(http://smart.embl.de/)做进一步的结构域分析，最终确定为月季R2R3-MYB家族基因。

3.2月季R2R3-MYB家族分类以及蛋白结构域分析

利用MEGA 6中的MUSCLE程序将鉴定到的月季R2R3-MYB家族蛋白序列和126个拟南芥R2R3-MYB基因进行多重序列比对。利用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统进化树，Bootstrap method设置为1 000，其他参数设置为默认参数。MYB家族基因内含子、外显子和基因组定位信息均来自于月季基因组数据库，利用在线软件GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因结构图，利用序列分析软件DNAMAN 5.0和在线软件Skylign (http://skylign.org/)分析月季R2R3-MYB蛋白的MYB保守域。利用在线软件MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)对月季R2R3-MYB蛋白进行基序预测，参数中预测数目设置为20，其他参数设为默认参数。

3.3染色体定位以及重复基因分析

根据月季基因组数据库，使用MapChart软件画出月季MYB基因家族在染色体上的位置。利用MCscanX软件分析月季MYB基因家族在基因组中的的复制事件。

3.4月季R2R3-MYB表达分析

从已公布的月季‘Old Blush’转录组数据中，提取月季R2R3-MYB家族基因的表达量相关数据(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/plants/R.chinensis)，利用TBtools工具(Chen et al., 2020)绘制表达量热图。

作者贡献

李谋亮是本研究的实验设计和实验研究的执行人；李谋亮、张晓妮及林胜男完成数据分析，论文初稿的写作；吴全淑参与实验设计，试验结果分析；包满珠及傅小鹏是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由“国家重点研发计划资助”—重要花卉种质资源精准评价与基因发掘(2019YFD1000400)资助。

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