萱草(Hemerocallis fulva)是原产中国的传统草本花卉。原有的分类系统将其归入百合科(Liliaceae)，近年来的研究将其归入阿福花科(Asphodelaceae) (Kim et al., 2010)。我国有萱草属野生种11个，不同的分类学者对“种”的界定略有歧见(中国植物志编委会, 1980)。19世纪，萱草传入欧美，经过园艺家百余年的不懈努力，目前，在美国萱草协会(American daylily society, ADS)登录的品种约有9万余个，种类十分丰富。

中国人自古以来对萱草情有独钟，大量诗词歌赋吟咏萱草为母亲花。萱草作为一种观赏植物，园艺学者不仅开展了大量的常规育种工作，还对其生殖生物学、遗传学、营养学、快繁技术、栽培技术等进行了大量研究，取得了积极成就(Liu et al., 2017; Hu et al., 2018; 陈羡德等, 2019; 李志娟等, 2019; 陈珺等, 2020; Cui et al., 2020)。作为一种夏季盛开的宿根花卉，其在丰富高温季节观赏资源的同时，自身也存在着一系列性状缺憾，制约了萱草的推广应用。这其中，花朵寿命短，单朵花朝开暮闭就是萱草观赏品质的明显不足。自上世纪90年来以来，植物生理学家、分子生物学家纷纷开展相关实验，试图从生理生化层面和分子生物学层面解析萱草花朵寿命短暂的科学原因，也取得了一定的成果。例如，有研究认为在萱草花朵衰老过程中，六碳糖含量迅速下降，磷脂合成在衰老早期受到抑制是花朵寿命短暂的重要原因(Bieleski and Reid, 1992)。另有研究认为果聚糖水解，伴随着花器官渗透压的升高，是萱草花朵开放的重要原因(Bieleski, 1993)。对萱草花朵细胞壁中的酶类进行研究，认为纤维素酶和果胶甲基酯酶在花朵开放前达到最高活性，而花朵开放后，多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶活性逐渐增高。热击处理可以加速纤维素酶活性降低，同时抑制多聚半乳糖醛酸酶活性的增加(Panavas et al., 1998)。此外，也有研究认为亮氨酸氨基肽酶活性的增加及维持是萱草花朵开放的重要原因，而其酶活的降低导致了花朵的衰败(Mahagamasekera and Leung, 2001)。

对萱草花朵寿命的研究，除了生理生化层面，在分子水平也有多篇研究论文报道。首先，采用文库构建技术，先后分离了若干个与萱草花朵衰老密切相关的结构基因，如半胱氨酸蛋白酶基因(SEN10)和巯基蛋白酶基因(SEN11)，它们都随着萱草花朵的衰老，表达量显著上升，认为该类基因与萱草的衰老负相关(Valpuesta et al., 1995; Guerrero et al., 1998)。此外，同样利用cDNA文库技术，获得了一批天冬氨酸蛋白酶和细胞色素P450类编码基因序列，并研究了他们随萱草花朵衰老的表达变化(Panavas et al., 1999)。近年来，随着基因组学和蛋白质组学技术的发展，在组学层面分析萱草花朵衰老机理的研究也有报道，例如通过iTRAQ技术，对萱草花朵衰老过程进行了比较分析，发现蔗糖转化酶是一种变化非常显著的蛋白质，该酶直接作用于碳水化合物蔗糖，有可能在花朵寿命和开闭规律等方面发挥关键作用(Ma et al., 2018)。

环己酰亚胺(Cycloheximide, CHI)又名放线菌酮，是一种抗生素，也是一种常见的蛋白抑制剂(Andreev et al., 2017)。曾有多篇报道指出环己酰亚胺可以调控花器官的衰老进程。例如，环己酰亚胺在木槿花(Hibiscus syriacus)开放之前施用，能够显著促进花朵衰老，但是开放之后再施用则对花朵寿命无影响(Seo et al., 2009)。对开放的切花鸢尾进行低浓度环己酰亚胺处理，结果发现，环己酰亚胺可以显著延缓鸢尾花瓣的内卷和衰老，延长了瓶插寿命(Van et al., 1995)。环己酰亚胺处理切花月季，同样可以延缓花朵的开放进程，延长其瓶插寿命(丛日晨等, 2001)。在萱草花朵衰老的研究上，很早就有报道指出，在离体状态下，用1 mmol/L环己酰亚胺处理萱草花朵，可以显著延缓花朵衰老进程，该过程中花朵含水量变化与清水处理差异不大，花径变化也不大，甚至这种状态可以维持180小时以上(Lay et al., 1992)。同样是在离体条件下，用0.5 mmol/L的环己酰亚胺溶液喷施萱草花朵，随后将其转入含有细胞分裂素的溶液中，发现萱草花朵的寿命可以延长至3天以上(Gulzar et al., 2005)。并且，在转入保鲜液之前，用低浓度的环己酰亚胺(0.01 mmol/L)处理花葶或用高浓度的(0.5 mmol/L)处理花朵，都可以显著延长瓶插寿命(Tajamul et al., 2011)。

尽管环己酰亚胺影响花朵寿命的研究很多，尤其是对萱草花朵寿命的影响也有了报道，但前人的研究都是在离体条件下，且未对环己酰亚胺通过糖和转化酶途径影响花朵寿命的潜在关联进行研究。在活体条件下研究环己酰亚胺对萱草花朵寿命的影响，能更加客观地反映其对内源生物活性物质的调控。本研究在前期工作的基础上，在活体条件下，通过对萱草花器官施用环己酰亚胺，测定了花朵衰老过程中主要糖类含量及蔗糖转化酶(简称转化酶)活性变化，期望揭示环己酰亚胺影响花朵寿命的内在关联，为今后更深入阐释环己酰亚胺调控萱草花朵寿命的分子机理奠定基础。

1结果与分析

1.1环己酰亚胺处理对萱草花被片形态和萼/瓣鲜重比的影响

与对照相比，0.5 mmol/L环己酰亚胺处理萱草花梗，从形态上看，并未引起明显的改变，一直到第二天花朵临近凋落时，该处理下的萱草花朵与对照在外部形态上高度相似，环己酰亚胺通过疏导组织并不能显著影响萱草花朵的形态变化，尤其是花朵开闭规律。而将环己酰亚胺均匀涂抹于萱草的花萼和花瓣上，情况却明显不同，表现在经过环己酰亚胺处理后，萱草的花被片迅速反应，2 h左右就表现出失水皱缩症状，尤其是花瓣的反应更加明显且强烈(图1)。但该反应并未随时间持续加重，一直到晚上花朵临近闭合前(19: 00)，经过环己酰亚胺处理的花被片仍然保持之前的萎蔫状态。直到第二天上午，对照花朵已经完全萎蔫闭合，但经过处理的萱草花被片全部保持开放状态，直至凋落也无法闭合(图2)。该浓度下的环己酰亚胺在促进萱草花被片失水萎蔫的同时，彻底阻断了其正常的闭合规律，使本该凋谢前花被片的正常闭合功能完全丧失，表现出花朵寿命延长的形态学假象。

图 1 环己酰亚胺处理后, 不同时间点萱草花朵的形态变化 Figure 1 Daylily flower morphology changes at different time points after CHI treatment

图 2 经过环己酰亚胺处理后，萱草花朵凋落前形态比较 Figure 2 Flower morphology comparisons when withering treated by CHI

为了更好的说明环己酰亚胺对花被片发育的影响，测定了不同处理下花萼与花瓣的鲜重比，结果显示，花朵开放前环己酰亚胺处理花梗，从早上7点到晚上7点，鲜重比变化不大，不同时间点之间的比值即使在5%水平，也没有显著差异，但总体上保持先升高后降低的趋势；而将环己酰亚胺均匀涂抹于花被片之后，在考察时间范围内，花萼与花瓣的鲜重比出现了显著的差异(表1)。与对照相比较，结果显示，处理花梗后，萼片与花瓣的平均鲜重比略微高于对照，两者差异不显著；而均匀涂抹花被片后，萼片与花瓣的平均鲜重比显著高于对照和处理花梗后的数值，在1%水平，表现出显著差异(表2)。该结果显示，0.5 mmol/L环己酰亚胺无论是处理花梗，还是处理花被片，都能够影响萱草花萼与花瓣的鲜重，且直接涂抹效果明显比间接作用显著。同时也说明，环己酰亚胺处理，对花瓣鲜重的影响大于萼片，导致二者鲜重比值升高。

表 1 不同处理方式下，环己酰亚胺影响萱草萼片/花瓣鲜重比值 Table 1 Different sepal/petal fresh weight ratio under different CHI treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

表 2 不同处理下，花萼与花瓣鲜重比的平均值 Table 2 The mean values of sepal/petal fresh weight ratio under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

1.2不同处理、不同花器官葡萄糖含量的变化

比较早、中、晚三个重要时间节点，发现双蒸水处理条件下，花萼中葡萄糖含量上午7点最高，中午略有降低，晚上花器官闭合前再次升高，但三个时间节点的含量差异不显著。而环己酰亚胺处理花梗后，发现萼片葡萄糖含量在中午最高，早7点次之，晚上闭合前最低，但三者同样没有显著性差异。对花萼均匀涂抹环己酰亚胺后，发现萼片中葡萄糖含量早7点最高，中午降低，晚上闭合前最低，显示环己酰亚胺直接处理花萼，能够持续降低花萼中的葡萄糖含量(表3)。

表 3 不同处理下花萼的葡萄糖含量(mg/g)变化 Table 3 Changes of glucose contents (mg/g) in sepals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

相较于花萼，环己酰亚胺涂抹花梗，能够使早上花瓣的葡萄糖含量显著提高，但是中午和晚上降低明显。直接涂抹花瓣，三个时间点在1%置信水平上无显著差异(表4)。

表 4 不同处理下花瓣的葡萄糖含量(mg/g)变化 Table 4 Changes of glucose contents (mg/g) in petals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

1.3不同处理、不同花器官果糖含量的变化

对不同处理下的果糖含量进行测定，结果显示，对照萼片中果糖含量从早上到中午存在上升趋势，且差异极显著，晚上闭合时，萼片中果糖含量急剧降低，变化同样极显著；环己酰亚胺处理花梗，早中晚三个时间点萼片中果糖含量都比对照高，且跟对照类似，晚上闭合时含量最低；环己酰亚胺涂抹萼片，导致中午和晚上萼片中果糖含量均比对照高。结果显示环己酰亚胺能够提高萼片中果糖含量(表5)。

表 5 不同处理下萼片中果糖含量(mg/g)的变化 Table 5 Changes of fructose contents (mg/g) in sepals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

对照中花瓣果糖含量与萼片类似，同样中午升高，而晚上闭合时显著降低；环己酰亚胺涂抹花梗，使得花瓣中果糖含量在三个时间点均较高；而涂抹花瓣后，能够使花瓣中果糖含量始终维持高水平，即使晚上8点，果糖含量依然远高于对照。萼片和花瓣中果糖含量变化，表明环己酰亚胺能够明显促进萼片和花瓣中果糖的积累(表6)。

表 6 不同处理下花瓣中果糖含量(mg/g)的变化 Table 6 Changes of fructose contents (mg/g) in petals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

1.4不同处理、不同花器官蔗糖含量的变化

对不同处理的蔗糖含量进行测定，结果显示，在萼片中，对照的蔗糖含量在晚间闭合前后出现积累高峰，显著高于白天的含量；环己酰亚胺无论是涂抹花梗还是涂抹萼片，都能够比对照提前开始蔗糖含量的升高，但晚间闭合时蔗糖含量没有对照高(表7)。

表 7 不同处理下萼片中蔗糖含量(mg/g)的变化 Table 7 Changes of sucrose contents (mg/g) in sepals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性大写, 字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

花瓣中，蔗糖含量同样在晚间闭合前后达到高值，且含量远高于早上和中午；而涂抹花梗后，花瓣中蔗糖含量只有早上略高于对照，中午和晚间均低于对照；但均匀涂抹花瓣后，花瓣中蔗糖含量显著升高，无论中午还是晚间，蔗糖含量都远高于对照和花梗处理组，显示环己酰亚胺直接作用于花瓣，对蔗糖的积累有显著的提升作用(表8)。

表 8 不同处理下花瓣中蔗糖含量(mg/g)的变化 Table 8 Changes of sucrose contents (mg/g) in petals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

1.5不同处理、不同花器官三种蔗糖转化酶活的测定分析

1.5.1细胞壁蔗糖转化酶酶活的测定分析

对不同处后理细胞壁蔗糖转化酶活性测定，结果显示，萱草萼片对照中细胞壁蔗糖转化酶活早中晚的趋势为先降低后升高。当对花梗进行环己酰亚胺处理后，发现萼片中细胞壁转化酶活性在晚间显著降低，且与早上活性存在极显著差异。这一趋势在均匀涂抹萼片时同样被观察到，且与早上活性相比同样存在极显著差异性降低。该结果说明外施环己酰亚胺，无论直接还是间接，都能够显著降低晚间闭合阶段萼片中细胞壁转化酶的活性(表9)。

表 9 不同处理下萼片中细胞壁蔗糖转化酶酶活的变化 Table 9 Changes of cell wall invertase activity of sepals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性   Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

萱草花瓣对照中细胞壁转化酶活的变化趋势为先降低后升高，且晚间闭合阶段，花瓣中细胞壁转化酶活远高于早上和中午值。对花梗进行环己酰亚胺处理后，花瓣中酶活先降低后升高的总趋势未变，但是酶活值明显低于对照。在均匀涂抹的花瓣中，该酶活数值从早上到晚间持续升高，但晚间闭合阶段，该处理酶活明显低于对照(表10)。

表 10 不同处理下花瓣中细胞壁蔗糖转化酶酶活的变化 Table 10 Changes of cell wall invertase activity of petals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性   Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

1.5.2细胞质蔗糖转化酶活性的测定与分析

分别测定不同处理下萼片和花瓣中细胞质转化酶的活性变化，结果显示，在萼片中，对照细胞质转化酶活性的变化趋势是先降低后升高，且变化极显著。环己酰亚胺处理花梗后，早中晚三个时间点对应的细胞质转化酶活性持续升高，差异极显著。但是均匀涂抹萼片，造成萼片中细胞质转化酶活性持续降低，差异同样极显著(表11)。

表 11 不同处理下萼片中细胞质蔗糖转化酶酶活的变化 Table 11 Changes of cytoplasm invertase activity of sepals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

花瓣中，对照的细胞质转化酶活性在晚间闭合阶段最高，与早上和中午存在极显著差异。环己酰亚胺处理花梗后，出现了中午降低晚间急剧升高的情况，且该处理下任一时间节点都比对照活性高。均匀涂抹花瓣后，细胞质转化酶活性持续升高，并且显著高于对照(表12)。

表 12 不同处理下花瓣中细胞质蔗糖转化酶酶活的变化 Table 12 Changes of cytoplasm invertase activity of petals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

1.5.3液泡蔗糖转化酶活性的测定与分析

液泡转化酶活性测定中，对照萼片酶活性从早到晚是迅速下降的趋势，中午和晚间差异不显著。环己酰亚胺涂抹花梗后，萼片中该变化趋势未变，但晚间酶活比早上和中午低的多，且极显著差异。环己酰亚胺直接涂抹萼片后，依然显示从早到晚酶活迅速降低趋势，且晚间闭合阶段，液泡转化酶活性比对照降低更为明显(表13)。

表 13 不同处理下萼片中液泡蔗糖转化酶酶活的变化 Table 13 Changes of vacuolar invertase activity of sepals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性 Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

花瓣中，液泡转化酶活性在对照中呈现中午急剧降低，晚间迅速升高的趋势，且差异极显著。环己酰亚胺涂抹花梗后，先降低后升高的变化趋势未改变，但晚间闭合阶段酶活数值比对照高。均匀涂抹花瓣后，中午酶活性显著升高，且极显著，晚间活性降低，但远比对照活性高，显示环己酰亚胺处理花梗或花瓣，都能够提升晚间闭合阶段花瓣中液泡转化酶的活性状态(表14)。

表 14 不同处理下花瓣中液泡蔗糖转化酶酶活的变化 Table 14 Changes of vacuolar invertase activity of petals under different treatments 注: ±号后代表标准偏差; 小写字母代表5%水平下差异显著性, 大写字母代表1%水平下差异显著性   Note: ± represents the standard deviation; lower case letters represent significance at 5% confidence level; capital letters represent significance at 1% confidence level

2讨论

萱草花朵朝开暮闭，显示出极强的规律性，花朵寿命十分短暂。CHI作为一种蛋白抑制剂，直接或间接施用于花朵，都会对其生理指标和形态变化产生影响，本研究以蔗糖代谢途径为切入点，研究了CHI与糖含量、酶活之间的动态关系，试图解析CHI经由生理变化影响花朵形态的科学原因。

CHI涂抹于花梗，是通过输导组织影响萱草花被片生理和形态变化，而直接涂抹于花被片则通过渗透作用可直接影响花朵形态。本研究发现，无论CHI涂抹在花梗上，还是直接涂抹在花被片上，花萼/花瓣鲜重比都比对照升高，表明CHI对花瓣鲜重的影响大于萼片。该结论与形态观察一致，间接说明CHI影响萱草花朵寿命时，对外轮萼片和内轮花瓣的调节是不一样的，且花瓣对CHI的刺激更加敏感。虽然萱草萼片和花瓣在形态上已经趋同进化，外观相似，但是由于二者是由不同成花决定基因控制，在生理和分子层面依然有较大的差异(Theißen et al., 2016)。在更深入的研究中发现，CHI单独涂抹萼片，导致萼片不能够闭合，花瓣可以闭合；单独涂抹花瓣，花瓣不能闭合，花萼有闭合趋势(未发表内容)。同时结合本实验，也说明CHI虽然可以通过输导组织传导，但其影响形态变化的作用效果远不如直接涂抹目标器官。

糖分的代谢往往与果实风味、品质密切相关(叶红霞等, 2019)。一般而言，植物器官衰老机理的研究主要集中于叶片等器官，通过突变体鉴定、图位克隆等技术分析衰老原因，而从糖代谢角度研究器官衰老，尤其是花器官衰老机理相对较少(武立权等, 2013; Kim, 2019)。蔗糖转化酶是蔗糖代谢过程中十分重要的一种酶，它不可逆的催化蔗糖变成果糖和葡萄糖，三种不同的蔗糖转化酶被认为在控制花器官脱落、器官衰老过程中发挥关键作用(Boyer and Mclaughlin, 2007; Zwack and Rashotte, 2013)。本研究中，CHI外施处理花梗，对萱草花器官形态变化影响不大，肉眼难以分辨出明显差异，但从生指标层面看，CHI影响了花器官蔗糖、果糖、葡萄糖含量变化，以及三种蔗糖转化酶活性。而将CHI直接施用于花萼和花瓣，萱草花器官则发生了较为明显的形态变化，施用当天可以观察到花瓣萎蔫严重，晚间无闭合趋势。施用次日发现花萼花瓣掉落前仍无法闭合，与对照和处理花梗都形成了鲜明的对比，表明CHI在影响萱草花朵衰老进程的同时，严重破坏了花被片原有的闭合规律。

本研究显示，与对照相比，CHI直接涂抹萼片和花瓣，对葡萄糖含量影响甚微，但对果糖和蔗糖含量影响较大，萼片和花瓣中果糖含量都明显比同时期对照高；花瓣中蔗糖含量在中午和晚间更是远高于对照，说明CHI更容易影响果糖和蔗糖在花被片中的积累。鉴于外施CHI显著促进花瓣形态衰老，且阻断了花瓣闭合，推测CHI促进果糖和蔗糖的积累直接或间接干扰了花被片的闭合规律。已有的研究也认为，蔗糖是植物生物钟节律的关键调节者，蔗糖通常与细胞壁蔗糖转化酶协同参与植物生物钟节律(Dalchau et al., 2011; Proels and Hückelhoven, 2014)。

  在晚间闭合阶段，CHI直接涂抹的萼片和花瓣，细胞壁蔗糖转化酶活性都比对照明显降低；而细胞质转化酶和液泡转化酶在CHI直接涂抹后，萼片中酶活性急剧降低，但在花瓣中迅速升高，显示CHI影响花瓣和萼片中转化酶活性方面，存在不同的调节机制，这也暗示三种蔗糖转化酶在器官形态和糖代谢变化中，发挥了不尽相同的调节功能。通过观察直接涂抹花被片第二天的花朵状态，可以发现，CHI阻止了萼片和花瓣闭合且提前促进了花瓣衰老。而晚上20:00的测定结果说明，细胞壁蔗糖转化酶活性降低有利于维持器官开放；细胞质和液泡蔗糖转化酶活性降低，同样有利于维持萼片的开放状态，但两者活性的升高，则有利于维持花瓣的开放状态。换言之，CHI导致的花瓣早衰且不闭合，与细胞质和液泡转化酶活性升高密切相关。今后通过克隆萱草不同蔗糖转化酶基因并开展遗传转化研究，是从糖代谢途径解析萱草花朵寿命及生物钟节律的重要研究内容。

用0.5 mmol/L CHI间接或直接处理萱草花器官，发现其对花器官形态和生理指标均有影响，但间接处理没有直接涂抹效果明显。直接涂抹花被片能够显著促进花瓣衰老，但阻断了萼片和花瓣闭合规律，研究显示，CHI涂抹花被片，显著影响器官内蔗糖和果糖含量，同时降低了细胞壁蔗糖转化酶活性。萱草花瓣和萼片应答CHI刺激形态变化不一致，糖类和转化酶指标也有异同，表明蔗糖和蔗糖转化酶途径可以控制萱草花朵衰老和闭合规律，但该途径在花萼和花瓣中的调控机制并不一致。

3材料与方法

3.1试验材料

试验用萱草品种为商品种“Pardon me”，该品种冬季休眠，一年抽薹开花一次，花期6月上旬至月末，单朵花朝开暮闭，寿命1天，表现出典型的短命特性。种苗最初购买自浙江虹越公司，为5年生丛生苗，定植于浙江省园林植物与花卉研究所试验基地，北纬30°4′15″，东经120°13′26″。露天园土种植，起垄栽培，垄高30 cm，长8 m，宽1.5 m。

环己酰亚胺购买自北京华越洋公司，用到的主要仪器有多功能微孔板检测仪，型号为Synergy H1 (Biotek instruments, 美国)。蔗糖、葡萄糖、果糖含量试剂盒，以及三种蔗糖转化酶测试试剂盒均购自苏州科铭有限公司。

3.2方法

萱草花朵开放前一天下午5点，用毛刷对长势一致的花朵花梗部位均匀涂抹0.5 mmol/L的环己酰亚胺溶液，每隔1 h涂抹一次，共涂抹3次，次日对处理花朵进行取样测定，记录为“处理花梗”。萱草花朵开放的当天，于上午7时刚刚开放时对花萼、花瓣均匀涂抹0.5 mmol/L的环己酰亚胺溶液，记录为“均匀涂抹”。双蒸水涂抹作为对照。所有处理在上午7时第一次取样，后续每隔2 h取样一次，至晚上7点止，用于测定萼片与花瓣的鲜重比。所有处理上午7点、中午12点和晚上8点花朵即将闭合前取样，用于测定萼片和花瓣的蔗糖转化酶活性以及蔗糖、果糖、葡萄糖含量。每个处理包括10朵不同花葶来源的花，每个样品随机取3个独立生物学重复，取样后液氮速冻，然后置于-80°C保存备用。

测定花萼与花瓣的鲜重比，是为了分析环己酰亚胺对花朵影响时，避免因不同花朵产生的重量大小差异，用同一朵花中的花萼/花瓣比，间接反映该处理对花器官的影响。本测定取样时，用锋利的刀片从花被片基部一次性切断，分离花萼和花瓣，称量重量后计算二者比值。

测定蔗糖含量采用ZHT-1-Y试剂盒(微量法)，葡萄糖含量采用PT-1-Y试剂盒(微量法)，果糖含量采用GT-1-Y试剂盒(微量法)；植物体内蔗糖转化酶根据分布区域不同，分为细胞壁蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶、细胞质蔗糖转化酶，三种转化酶活性的测定分别采用BAI-1-Y、SAI-1-Y和NI-1-Y试剂盒(微量法)，酶活按照蛋白质和鲜重两种不同的方法进行计算(μg/min/mg prot.和μg/min/g 鲜重)。样品处理及测定严格按照试剂盒操作说明进行。

3.3数据分析

试验产生的数据采用Excel 结合DPS软件进行分析。

作者贡献

马广莹是本研究的实验设计和实验研究的执行人；史小华、詹菁及朱开元完成数据分析，论文初稿的写作；田丹青参与实验设计，试验结果分析；马广莹是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由浙江省自然科学基金(LY20C160007)和浙江省重点研发计划(2019C02025)共同资助。

参考文献

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