Development and Purity Identification of InDel Marker Based on re-Resequencing of “modilong” Wax Gourd

Wang Riyong　Xie Lingling　Zhou Huoqiang　Wu Yifei　Xiao Wei　Zhang Zhuqing　Mi Baobin*

Research institute of vegetables, Hunan academy of agricultural sciences, Changsha,410125

Corresponding author, mibaobin@hunaas.cn

Abstract　In order to establish a simple, economic, accurate and reliable method to identify the purity of wax gourd hybrid seeds, an InDel marker characterized by significant differences was developed via whole genome re-sequencing of parent plants of ‘modilong’ wax gourd; Then the developed InDel molecular marker was used to identify the purity of hybrid seeds of ‘modilong’ taking the DNA of its hybrid seeds and parent plants as test DNA, and the obtained results were compared with field identification results. A total of 466 pairs of InDel markers were screened by genome re-resequencing of parent plants of ‘modilong’, and 26 of which with distinct differences were selected to be amplified and both got the strip. Among them, 7 pairs of primers can clearly distinguish the purity of wax gourd samples. The purity of InDel molecular marker identification was more than 99 % consistent with the results of field plot planting identification, indicating that the purity results obtained by different methods were highly consistent. The InDel molecular marker screened in this study could be used as the purity identification of wax gourd hybrids.

Keywords　Wax gourd; Seed purity; Indel molecular marker

冬瓜(Benincasa hispida (Thunb.) Cogn.)是葫芦科重要蔬菜作物，其营养丰富，兼具药用和保健功效，是健康的高钾低钠食品(Jiang et al., 2014)。冬瓜耐贮运性好、货架期长、产量高，已成为调节市场周年均衡供应的主要蔬菜之一(Jiang et al., 2013)。中国的冬瓜种植面积居世界之首，年播种面积32万hm²以上。杂交冬瓜品种纯度是保证杂种优势得以发挥的基础，也是衡量杂交冬瓜种子质量的主要指标，由于在冬瓜杂交制种过程中，人工去雄不彻底或漏去雄，常会出现假杂交种，导致杂交品种优势下降，给生产造成巨大经济损失。因此，为了有效提高优良品种的生产质量，建立一套快速、准确的冬瓜杂种种子纯度鉴定方法是冬瓜生产经营过程中需要迫切解决的问题之一(刘政国等, 2019)。采用传统田间鉴定种子纯度方法，受各种因素影响，时效及准确性都有一定的局限性；采用分子标记则可便于标准化、规模化、快速鉴定商品种纯度。尤其是冬瓜基因组的公布(Xie et al., 2019)，可为快速筛选分子标记提供可行性。冬瓜纯度鉴定目前报道的室内鉴定分子标记有RAPD (卢文佳等, 2010)和SSR (何晓明等, 2017; 陈庆明等, 2020)等。

近年来，随着基因组测序技术的快速发展，出现了包括InDel和SNP在内的第三代新型分子标记类型，其具有经济实用、特异性高、稳定性好等特点。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。就分布密度而言，InDel仅次于SNP，但远高于SSR，而SNP受限于基因型分型技术，在小型和中型检测中需要特殊的设备，成本高且操作复杂，因此，InDel标记的应用前景广阔(陆海燕等, 2019)。InDel是指2个亲本之间因核苷酸的插入或缺失而存在的区别，可根据该差异用来进行区分两亲本(王钰等, 2019)。InDel标记稳定性好、多态性高、带型简单，更易应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种等领域(吉康娜等, 2019;)，目前已在玉米(姚宗泽等, 2020, 江苏农业科学, 48(1): 79-84.)、番茄(张景龙等, 2019)、大白菜(刘栓桃等, 2019)等作物上农作物种子纯度检测，结果准确可靠。

1结果与分析

1.1重测序开发墨地龙冬瓜InDel标记及筛选验证

通过对墨地龙冬瓜的父母本进行全基因组重测序，经参考基因组对比后，利用GATK和Primer 6.0等软件开发InDel 标记，共筛选到466对InDel标记，选择其中差异较大的26对进行引物合成扩增(表1)，发现均可以扩增出清晰条带，其中chr640818838、chr412955559、chr1252341989、chr1223923504、chr717248263、chr413443261、chr245098788等7对引物在父本(L2)、母本(D6)及F1各12株中可扩增出较为显著差异的条带，可用来区分墨地龙冬瓜商品种纯度(表2; 图1)。

1.2墨地龙冬瓜田间鉴定与室内鉴定纯度

供试所用墨地龙冬瓜种子来自湖南兴蔬种业有限公司制种基地，利用chr640818838、chr1252341989和chr1223923504等7对InDel标记引物对墨地龙冬瓜进行扩增，电泳图均表现出“双亲互补型”，且谱带清晰，可明显区别杂交种及非杂交种(图2)，其中引物chr640818838扩增的DNA模板纯度为100 %；引物chr1252341989存在2个非杂交种；引物chr1223923504存在3个非杂交种，其余引物扩增样品纯度为100 %。选取7份墨地龙冬瓜商品种，经筛选的InDel标记纯度鉴定结果与田间鉴定纯度纯度有一定差异，但差异不明显。目前国标冬瓜生产大田用种现行标准纯度为96% (赵胜男等, 1996, 中华人民共和国国家标准: 瓜类作物种子瓜类, GB16715-1996)，室内鉴定结果均值与田间鉴定表明样品1纯度不达标，而样品2-7纯度符合国标，可应用于商品种推广种植。

2讨论

目前冬瓜、节瓜杂种优势已被广泛地应用于生产，冬瓜的纯度的快速准确鉴定是确保种子质量的技术保证，也是品种纯度检测实现商业化的前提，可以为企业销售种子争取时间，进而确保农户的利益(陈庆明等, 2020)。中国对于冬瓜商品种的杂交纯度鉴定基本采用田间鉴定法，即根据作物在形态学上的表现来判断种子是否为杂交，存在检测周期长、费时费工、土地占用面积大，加之可用于鉴定杂交种纯度的形态特征数量有限，且多数形态特征还易受环境影响存在一定误判可能性。通过重测序技术寻找亲本之间的差异具有准确、快速等优势，但重测序开发的标记在实际应用中并非100 %存在差异，可能是测序深度及数据过滤等存在两样品存在序列差异的假象(张志刚等, 2016)，在本研究中，选择的26对引物存在较大差异，但电泳时可明显区分的电泳对有7对，当然也可以加长电泳时间或增加聚丙烯酰胺胶浓度增大差异进行纯度区别。

不同引物序列对墨地龙冬瓜纯度鉴定结果存在差异可能是由于田间取样与纯度取样不是同一批样品，存在取样误差等因素；另室内鉴定存在DNA提取或PCR或电泳上样等差异，导致部分电泳孔道电泳条带较浅，不太容易判断杂交种及非杂交种，因此相应的数据统计时去掉该通道，造成不同InDel引物鉴定的纯度存在细微差异，但不同引物间并无明显差异，均可用于墨地龙冬瓜的纯度鉴定。本试验针对黑皮冬瓜品种墨地龙，通过快速提取冬瓜种子DNA，筛选7对特异性引物结合田间表型进行品种纯度鉴定，建立了较为准确有效的纯度鉴定体系，纯度鉴定结果所需的时间由传统的90 d缩短至5~6 d，鉴定效率大大提高；传统的田间鉴定方法每亩可鉴定1 000株，每个样品100株，成本价在0.8万元左右，则平均每个的样品鉴定成本为800元，而采用本发明申请方法则每个样品鉴定的成本控制在150元以内，仅为传统方案的20 %左右，经济效益明显。

3材料与方法

3.1冬瓜基因组重测序和InDel位点分析及引物设计

使用天根生化公司植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取冬瓜基因组总DNA，基因组重测序由北京贝瑞和康科技股份有限公司完成。分别对父母本进行10x深度测序，并对获得的原始数据质控合格后，通过BWA软件对有效的测序数据比对冬瓜参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA430006)，比对结果用SAMTOOLS删除重复。InDel检测分析使用GATK软件，根据InDel位点在参考基因组上的位置信息，使用SnpEff软件进行注释，筛选定位于冬瓜基因组上差异碱基数较大，测序深度较深的位点序列利用Primer 6.0设计引物(吉康娜等, 2019)。

3.2基因组DNA的提取

引物筛选所用父本(L2)、母本(D6)及F1(墨地龙冬瓜)各12株的DNA采用改良的CTAB法提取(王钰等, 2019; 余巨全, 2020)；采用碱式法提取冬瓜种子DNA：冬瓜种子催芽后选取0.5 cm左右的根尖组织置于96孔PCR板中，加入0.1 mol/L的50 mL NaOH溶液于沸水加热5 min，然后加入150 mL的0.1 mol/L的Tirs-HCl进行中和，冷却后取2 μL为模板进行PCR扩增，提取的DNA可置于-20℃保存。

3.3 PCR扩增体系及程序

使用上述碱式法提取的DNA为模板，以InDel分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR产物，PCR扩增体系为10 μL，PCR体系为2×PCRmix 5 μL，F引物及R引物各0.3 μL，模板1.5 μL，补足ddH₂O至10 μL。PCR扩增程序为95 ℃ 5 min，95℃ 30 s，59 ℃~60 ℃ 30 s，72 ℃ 45s，循环30-35次，72 ℃ 10 min，16 ℃保存。

3.4基因型统计

对扩增获得的目的产物，采用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，经银染后(林增顺等, 2019)在胶片观察灯上观察读带，将父母本与杂交种子的带型进行对比，父本具有1条共显性特征带，母本具有1条共显性，同时具有父母双亲本的2条特征带的种子鉴定为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均视为假杂种。杂交种与总条带的比例即为种子杂交纯度。

3.5田间形态学验证

在冬瓜雌花开放时，根据幼瓜子房形态特征进行初步调查统计；待雌花开放20 d后再次调查瓜长、横径及果形指数等特征确定墨地龙冬瓜的纯度。田间纯度=(供检株数-异形株)/供检株数×l00 %。

作者贡献

肖伟、吴艺飞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王日勇完成数据分析，论文初稿的写作；周火强、张竹青及谢玲玲参与实验设计，试验结果分析；弭宝彬是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由本研究由湖南省重点研发计划(2018NK2024)、湖南省自然科学基金(2018JJ3301)、国家特色蔬菜产业体系种子种苗岗位(CARS-24-A-14)和大宗蔬菜产业体系长沙综合试验站(CARS-23-G-29)共同资助。

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