Development and Characterization of Genome-SSR Markers in Flowering Cherries

Li Shuigen¹　Guan Yuan²　Li Xiufen¹　Zhu Jijun³　Li Jikai^1*　Zhu Jianjun^1*

1 Forest & Fruit Tree Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai, 201403;2Crop Breeding & Cultivation Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai, 201403; 3 Shanghai Botanical Garden, Shanghai, 200231

* Corresponding authors,jkli@sibs.ac.cn;zhujianjun@saas.sh.cn

Abstract　In order to develop genome-SSR (simple sequence repeat) molecular markers of Cerasus, the genome sequence survey of Cerasus cerasoides was done on IlluminaNovaSeq PE in this study. Microsatellite sequences were identified by using Perl script MISA, and 100 pairs of primers were synthesized randomly for primer polymorphism screening. Then the primers with easy amplification and high polymorphism were selected to detect and analyze the genetic diversity of 45 flowering cherries by fluorescence labeled capillary electrophoresis. The results showed that there were 113 571 SSR loci (≥5 repeats) including 53.31% single nucleotide motifs, 36.64% dinucleotide motifs and 10% other motifs.21 SSRs were developed and their polymorphisms were evaluated in flowering cherries. A total of 215 alleles were detected. The mean number of alleles per locus was 10.24 and the mean heterozygosity was 0.38. The phylogenetic tree constructed by SSR markers could well reflect the genetic relationship among 45 tested Cerasus species. In this study, new SSR molecular markers were developed, which can be used for genetic diversity analysis and molecular marker assisted breeding of Cerasus.

Keywords　Cerasus cerasoides; Genome-SSR; Microsatellites; Molecular marker; Genetic diversity

樱花(Cerasus sp.)为蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)的一类具有重要观赏价值的园林树种，在全世界范围内广泛栽种，由于其艳丽的花朵，在商业和住宅区景观设计中，经常被用于行道树。野生樱花品种极其丰富，主要分布于北半球的温带，特别是在东亚地区，包括中国，日本和韩国。进行樱花的育种工作，培育具有卓越观赏特性和抗性强的樱花品种，可以满足不同地区人们的赏花需求、丰富园林设计的树种选择。然而野生樱花存在自然杂交和种间杂交的发生，从而导致名称，起源和分类单元之间的界限混乱，经常出现同种异名或同名异种的情况，给引种栽培和育种工作带来困难(Kato et al., 2012; Ogawa et al., 2012)。

分子遗传学方法使阐明植物物种之间的遗传关系和促进分子标记辅助育种成为可能。特别是简单序列重复(SSR)标记具有丰度高，基因组内随机分布，高多态性信息含量(PIC)和稳定的共显性(Fraser et al., 2004; Chen et al., 2006)，已被证明对植物基因分型和栽培品种鉴定极为有效。前人已经采用SSR标记对李属物种之间的系统发育关系进行了研究。SSR被用来鉴定西班牙东北部欧洲李(Prunus domestica)的本地品种与其它变种之间的遗传关系(Urrestarazu et al., 2018)。Zhao等(2015)对中国野生樱桃李(Prunus cerasifera Ehrhart)的遗传多样进行了SSR分析。Dirlewanger等(2002)从富含CT的桃基因组文库中筛选出41个SSR标记，并应用于酸樱桃(Prunuscerasus)、扁桃(Eugenia uniflora)、草莓(Fragaria×ananassa Duch.)等的遗传多样性分析。在观赏樱属植物中也有SSR标记的研究，并用于区分樱花的种类、杂种及品种(Hongmei et al., 2009; Kato et al., 2012)。伊贤贵等(2018)对山樱花群体的遗传多样性采用SSR分析。聂超仁等(2018, 2018年中国观赏园艺学术研讨会)采用荧光标记电泳法对54种国内栽培的观赏樱属品种进行了SSR分析。

由于樱花参考基因组缺乏，现有的SSR标记大多为EST (表达序列标签)来源的，而没有樱属基因组SSR的报道。公开可用的EST和转录组数据库为EST-SSR的开发提供大量的参考数据(Thiel et al., 2003; Park et al., 2013; Zhang et al., 2018)，然而由于EST-SSR位于编码区，序列相对保守，导致多态性水平偏低。而基因组SSR具有高多态性，在评估植物遗传多样性研究中更有优势。对于缺乏参考基因组序列的物种，基因组序列勘测(GSS)可用于开发基因组SSR (Cheng et al., 2009; Wei et al., 2014; Liu et al., 2016; Zhou et al., 2016)。本研究基于喜马拉雅樱花(Cerasuscerasoides)的基因组勘测序列，鉴定并开发了新的基因组SSR。对筛选的21个SSR标记在45种观赏樱属植物中进行鉴定，为樱属植物的遗传标记开发、亲缘关系鉴定、分子标记辅助育种提供参考。

1结果与分析

1.1喜马拉雅樱花基因组勘测序列获得

对插入片段大小为350 bp的文库进行测序，共获得32 514 513 900 bp的原始数据。在对原始数据进行过滤和校正后，获得有效读段数据(clean reads) 32 437 856 100 bp，其中Q20和Q30分别达到96.85%和91.61%，GC含量为36.91%。通过K-mer分析表明，喜马拉雅樱花基因组大小为369.68 Mbp，基因组杂合率为0.37%。对clean reads进行组装，共获得279 319个重叠群(Contig)和190 282个基本骨架(scaffold) (表1)。原始数据上传至NCBI公共数据库获得登录号SRR8403066和SRR8403067。

1.2 SSR标记的开发与鉴定

使用MISA脚本对组装好的scaffold进行SSR位点的筛选和鉴定，结果共发现113 571个SSR (≥5个重复序列)。在这些SSR标记中，单核苷酸是最丰富的基序类型，数量为60 545，占所有SSR的53.31%。二核苷酸基序的数量仅次于单核苷酸，占所有SSR的36.64%。其余基序类型(从三核苷酸到六核苷酸)占所有SSR的10%。对SSR的重复数类型进行分析表明，最常见为十个串联重复的SSR (数量29 108; 占比25.63%)，其次是具有11个串联重复的SSR (数量14 333; 占比12.62%) (图1)。

1.3 SSR标记的验证和多态性检测

为了验证基因组SSR的有效性，我们随机选择了100个SSR (SSR1-100)，在供试材料中选择3个具有代表性的樱花品种进行多态性检测。结果100个SSR位点均能扩增出清晰的条带(数据未显示)。然后我们从中筛选出21个条带清晰、扩增稳定、多态性好的SSR位点，其中包含10种二核苷酸基序，6种三核苷酸基序和5种四核苷酸基序。设计了相应的21对引物(表2)，并基于荧光毛细管电泳的最高峰位置记录目标PCR产物(图2)。

随后，在45个樱花品种中对这21个SSR基因座的多态性进行检测评估(表3)。结果总共检测到215个等位基因，平均每个位点有10.24个等位基因。其中SSR19位点产生的等位基因数量最多，为24个，而在SSR7、SSR20、SSR50、SSR58、SSR64上仅观察到5个等位基因。有效性数值范围为78%~100%。基因多样性(预期杂合度)范围为0.38~0.92 (平均为0.71)。杂合度数值的范围为0.05~0.75 (平均值为0.38)。多态性信息含量PIC值的范围为0.37~0.92(平均值为0.68) (表3)。我们发现，这21个SSR标记的有效性最低为78% (SSR58)。其中7对SSR引物可以在所有供试樱属品种中扩增出条带，包括SSR69、SSR74、SSR81、SSR88、SSR89、SSR90和SSR93 (表3)。

1.4观赏樱属植物的亲缘关系分析

对荧光标记毛细管电泳结果进行解析，并采用UPGMA法进行聚类分析，获得45种樱属观赏植物的亲缘关系树状图(图3)。从聚类图上可知，在相似系数0.79处，可将45种樱属植物分为2大组(用A和B表示)。其中B组仅包含华中樱和崖樱。其余大部分种类则分到A组。A组又可分成3个亚组(A1, A2, A3)。其中A1亚组聚集了一些野生品种，包含亲缘关系较近的高盆樱和喜马拉雅樱。钟花樱及其地理位置的变种(寒绯樱, 琉球寒绯樱)聚在A1亚组的一个分支，并且与云南樱和牡丹樱的亲缘关系也较近。迎春樱、毛樱桃和刺毛樱桃也聚在一起。A2和A3亚组则聚集了绝大多数的栽培品种，其中亲缘关系最近的飞寒樱和广州樱，相似系数达到了0.95，两者和阳光樱聚在了一起，存在较近的亲缘关系。一些栽培品种及其杂交子代或亲本大多也聚集在一起，例如阳春樱、美国樱、染井吉野樱和江户彼岸樱聚在一支；寒樱、冬樱和大岛樱等聚为一类。郁金樱和御衣黄樱的相似系数很高，与太白樱聚在了一类，属于晚樱品种，并且与它们的亲本山樱花遗传距离较近。樱桃和椿寒樱聚在了A2亚组的一个小分支，印证了两者的亲缘关系。A3亚组中包含小彼岸樱、越之彼岸樱和八重红枝垂，三者具有相近的亲缘关系。

综上，采用这21个基因组SSR标记构建的樱属亲缘关系聚类图，与采用传统的形态分类学构建的进化关系相似，并且较好的地将野生种和具有亲缘关系的栽培种进行了区分和关联，能够有效鉴定樱属观赏植物的基因型和进化关系。

2讨论

SSR由于其高度多态，共显性和易复制等特征而被广泛应用于遗传多样性分析和分子标记辅助育种(Yang et al., 2015)。与EST-SSR相比，基因组SSR标记具有高度多态性，能够更高效地进行遗传多样性分析(Parthiban et al., 2018)。与琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上的常规手动读取DNA片段相比，使用荧光标记毛细管电泳可准确读取PCR产物片段大小，并且数据更准确，具有高效和自动化等优点(Liang et al., 2018)。本研究通过筛选喜马拉雅樱花的基因组勘测序列，开发了全新的樱属植物基因组SSR标记，并采用荧光标记毛细管电泳法进行分析，为观赏樱属植物的分子标记研究提供参考。

本研究通过对喜马拉雅樱花基因组勘测序列进行分析，共发现113 571个SSR位点，并且具有相对丰富的二核苷酸和三核苷酸基序。在其他一些植物基因组中也发现了高频率的二核苷酸和三核苷酸基序类型(Cheng et al., 2009; Wei et al., 2014)。其次本研究鉴定出的SSR中，具有10个串联重复序列的SSR最常见，与甘蓝型油菜(Brassica napus)基因组勘测的研究结果一致(Cheng et al., 2009)，但与芝麻(Sesamum)和疫霉(Phytophthora) (常见的重复基序分别为六个和四个重复类型)的研究结果不同(Schena et al., 2008; Wei et al., 2014)。可能不同植物的SSR类型存在差异，SSR具有丰富的序列多样性。

我们使用SSR标记对45种樱属植物进行遗传多样性分析，平均PIC值为0.68，其中有19个SSR的PIC值大于0.5(表3)，这表明通过基因组勘测序列开发的SSR标记具有很高的信息量。先前研究中开发的樱属植物SSR分子标记，几乎都来自李属，尤其是桃，且大多数为EST-SSR(Hongmei et al., 2009; Tsuda et al., 2009; Kato et al., 2012)。Kato等(2012)使用SSR鉴定了日本观赏樱属品种的遗传多样性，期望杂合度为0.58。Tsuda等(2009)设计了13个EST-SSR分子标记，在6种观赏樱花品种中进行扩增，并采用荧光毛细管电泳法进行分析，结果获得平均等位基因数量为3.9。而我们开发的基因组SSR标记，扩增的等位基因数量和PIC值均高于Tsuda等的研究，表明新开发的樱属植物SSR标记有效性更高。

在本研究中，我们选取的45个供试品种涵盖范围广，包含主要栽培品种和一些重要的野生种质，结果表明新开发的基因组SSR标记的有效性高达百分之八十，其中7对引物可以在所有品种中扩增出条带。在之前的一些研究中，来自李属的SSR被用于分析樱属品种的遗传关系(Hongmei et al., 2009; Tsuda et al., 2009; Kato et al., 2012)。由于SSR基因座可以跨物种扩增，我们开发的21个SSR分子标记或许也能应用于樱属和李属植物之间的遗传多样性分析，但是需要进一步的实验来验证。

樱花品种繁多，分类方法不尽统一。根据我们采用的遗传标记分析，华中樱和崖樱聚在一起，并且与其他品种遗传距离较远，两者均为原产于中国的樱属野生种，基于形态特征的分类学也将其放在一起(俞德浚等, 编著, 1986, 科学出版社, 中国, 北京, pp.76)。其余种类基本上按照野生系列(A1)和栽培系列(A2和A3)进行聚类。野生系列包括高盆樱种系和钟花樱种系。来自日本的品种，包括牡丹樱，琉球寒绯樱，寒绯樱和深山樱也聚集在这个小分支中，表明该分支的种质可能具有共同的祖先。在现有研究中也记录了高盆樱和深山樱之间具有密切的亲缘关系(Hongmei et al., 2009)。在聂超仁等(2018, 2018年中国观赏园艺学术研讨会)的研究中，也将高盆樱聚在了钟花樱组，并认为钟花樱种系是较为原始的高盆樱种系向中国东南及南部地区迁移过程中逐步形成的变种。栽培系列聚集了绝大多数的樱花栽培品种，并且基本上按照杂交品种的共同亲本进行聚类。河津樱，大渔樱，飞寒樱和广州樱基于他们已知的共同祖先寒绯樱而聚在一起。椿寒樱与它的亲本樱桃聚集在一起。江户彼岸樱是阳春樱、美国樱、染井吉野樱的亲本，它们聚为一小类。由于山樱花和樱桃是现有樱花栽培种的野生原始祖先，也被分到了栽培系列的大分枝里。这些研究结果表明SSR标记较好地反应了观赏樱属植物的亲缘关系，能够有效鉴定樱属植物的野生和栽培品种的遗传多样性。

3材料与方法

3.1植物材料

用于基因组序列勘测的材料为上海市农业科学院奉浦院区引种的5年生喜马拉雅樱花(朱建军等, 2017)，于2018年3月采集新发生的幼嫩叶片，迅速植于液氮中冷冻，并保存于-80 ℃。用于SSR标记评估的45份观赏樱属品种(表4)分别采自上海植物园和上海农业科学院奉浦院区，于2019年春季采集各樱花品种的幼嫩叶片，于液氮中冷冻，并保存于-80 ℃中用于基因组DNA的提取。

3.2基因组DNA提取、Illumina测序和序列拼接

采用CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)法提取樱花叶片的基因组DNA。通过Nanodrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc, 美国)检测DNA的质量和浓度。将高质量的喜马拉雅樱花基因组DNA通过超声处理打成片断，然后筛选出350 bp大小的片段用于测序文库构建。将材料送至诺禾基因有限公司(中国北京)，在IlluminaNovaSeq PE平台上进行测序。测序完成后，对原始数据(Raw data)进行过滤处理并获得clean reads。然后通过De Bruijn Graph法(Li et al., 2010)获得contigs，并根据clean reads确定contigs的方向、减少并缩短空缺(gap)，最终形成scaffold。原始数据上传至NCBI公共数据库。

3.3 SSR位点鉴定及引物设计

基于喜马拉雅樱花基因组勘测序列，采用Perl脚本MIcroSAtelitte (MISA)进行微卫星DNA序列的识别。然后使用Primer Premier 3.0在SSR位点的侧翼区域设计引物。由擎科生物(中国上海)进行荧光(FAM)标记引物的合成。

3.4 PCR及荧光标记毛细管电泳

PCR反应采用50 μL体系，其中包含DNA模板1 μL (50 ng /μL)、上下游引物(10 μmol/L)各2 μL、Green Mix (上海生工) 45 μL。PCR反应程序为：预变性98 ℃，2 min；变性98 ℃，10 s；退火10 s (温度根据不同的SSR引物而设定)；延伸72 °C，10 s；循环30次；最后在72 °C下再延伸2 min，并保持在4 °C。

取0.5 μL的PCR产物用于毛细管电泳上样，上样液包含0.5 μL的500 LIZ大小的标准液(Applied Biosystems Inc, 美国)和9 μL的二甲酰胺(Applied Biosystems Inc)。上样液采用如下处理：98 °C，5 min，置于冰上2 min，4000 rpm离心1 min。使用ABI 3730XL遗传分析仪(Applied Biosystems Inc)对上样反应过程进行分析。在毛细管电泳过程中，PCR产物的分离过程会自动记录到单独的GeneScan文件中，然后使用GeneMapper 4.0软件(Applied Biosystems Inc)对收集的原始数据进行分析。

3.5数据统计分析

根据荧光标记毛细管电泳结果，采用PowerMarker 3.25计算基因型个数、等位基因个数、基因多样性、杂合性、多态性信息指数。利用NTSYSpc-2.11软件包(Exeter software Setauket,美国)构建基于UPGMA聚类算法的树状图。

作者贡献

李水根是本研究的执行人，完成数据分析和论文的写作；关媛和李秀芬参与基因组勘测、荧光毛细管电泳及数据分析；朱继军提供遗传多样性分析的植物材料。李记开完成生物信息学分析、SSR引物设计和荧光毛细管电泳；朱建军是试验的构思者，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由上海市种业发展项目(沪农科种字(2017)第1-6号)和上海市市级农口系统青年人才成长计划项目(沪农青字(2018)第1-9号)共同资助。

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