Triple Real-time Fluorescent PCR Screening of Transgenic Components in Maize

Wang Fengjun ^*　Chen Qiang　Xu Haifeng

Department of Applied Engineering, Zhejiang Institute of Economic and Trade, Hangzhou, 310018

*Corresponding author, wfj0808@126.com

Abstract　In this study, a triple real-time fluorescent PCR system was developed for rapid detection of genetically modified components in maize and processed products. Specific primers and probes were designed for single copy endogenous gene adh1 (encoding alcohol dehydrogenase), promoter (p-35s promoter of cauliflower mosaic virus) and t-NOS Terminator (gene terminator of carmine synthetase of Agrobacterium tumefaciens). Specificity analysis was performed on 8 samples of non corn crops such as soybean meal, cotton seed and wheat flour. Applicability analysis and routine sample screening detection were performed on 10 maize seed samples and 41 maize food samples. Standard curve method was used to verify the detection limit and repeatability of the method. The results showed that the system could simultaneously detect 3 target genes in a reaction tube using transgenic positive sample DNA as template, and only endogenous gene was detected in non transgenic maize samples, and the detection results were consistent with the information of the samples to be detected; The amplification efficiency of adh1, p-35S and t-NOS target genes was 96.84%, 94.92% and 93.80% respectively. Their linear correlation coefficients were 0.999, 0.990 and 0.997 respectively. The detection limit was 10 copies each. This method has strong specificity, good repeatability and high sensitivity, which provides a method reference for screening and detection of genetically modified components in maize and its deep processed products.

Keywords　Triple real-time fluorescent PCR; Maize; Transgenic components; Screening and detection

随着生物技术在农作物质量和性状改良上的不断应用和发展，玉米(Zea mays L.)、大豆(Glycinemax L.)、棉花(Gossypium spp)和油菜(Brassica napus L.)等四大作物均已大范围使用转基因技术。玉米是世界上第二大规模的商业化食用经济作物，全球种植面积约5.89×10⁷公顷，转基因渗透率已达到30% (杜建中, 2019; ISAAA, 2019)。玉米作为重要的农作物产品，广泛用于动物饲料和食品加工材料，种植面积占比在逐年上升。

生物技术的推广使得作物的保鲜性能更好，质量和营养价值更高，降低农业生产成本，增加作物产量(Levidow et al., 2000)。但转基因产品可能产生的毒性物质(郭利磊等, 2019)，抗营养因子、过敏原和抗药性(Marvier, 2002)，将对人体健康造成难以估量的不良影响，需在正式批准上市之前接受严格的筛查和检测(Li, 2012)，对外源基因表达物质和转基因技术应用过程中产生的新物质进行毒理学检测和评价(Reiner, 2003)。因此随着转基因技术的发展应用，基因检测方法的改进和升级成为当前食品安全领域的研究热点 (Bucher et al., 2014; Wang et al., 2014; 王凤军等, 2018; 李夏莹等, 2019; 常志远等, 2019)。Geoffrey等(2013)应用多重实时荧光PCR对7份样品中的47个靶点进行鉴定，每个反应系统设置阳性对照、阴性对照和一个内参照基因，根据仪器的配置和性能检测的绝对限值在1~16个拷贝之间。多重实时荧光PCR技术在一个反应管中加入标记有不同波长荧光基团的序列特异性荧光探针(Zhang and Guo, 2012)可同时对多个转基因元件进行同步检测(Yoichiro et al., 2002)，快速判断样品中是否含有转基因成分(Ao et al., 2011; Randhawa et al., 2012; Li et al., 2013; Randhawa and Singh, 2013)。

本研究利用多重荧光定量PCR技术高通量特征，以国际上公开的常用的外源转基因靶标序列为依据，设计建立同时分析3条靶标基因的检测体系，对转基因玉米及其深加工制品中常见的外源基因的存在和表达情况进行多重快速检测，本研究建立的多重实时荧光PCR方法对玉米及其深加工制品中转基因成分的全程监测和快速监控，确保食品安全有重要意义。

1结果与分析

1.1核酸样本的质控

提取后的样品使用NanoDrop-one核酸蛋白分析仪测试基因组DNA的含量和纯度，其中OD 260/280 nm比值在1.5~2.2之间，OD 260/230 nm比值在0.8~1.8之间，DNA溶液的浓度在80 ng/L~250 ng/L，经SN/T 1204-2016检测MON863转基因样本的内源基因，循环阈值(cycle threshold, Ct)在15~23之间，DNA的提取质量满足后续多重实时荧光PCR的分析要求。

1.2三重荧光PCR反应引物和探针筛选

本研究设计了玉米内参照基因adh1和外源基因p-35S、t-NOS的多个引物探针组合，为避免同一反应管中多个靶标荧光信号相互干扰，使用不同的报告基团进行标记(表1)。

1.3反应体系的优化和建立

退火温度和引物探针的浓度是影响实时荧光PCR检测效率和灵敏度的关键条件。经引物探针TM值分析及退火温度的梯度试验，确定退火温度为58 ℃时，空白对照无引物二聚体等交联情况，检测各基因无信号干扰。经引物和探针浓度的十字交叉试验以及各报告基团的发射光谱，确定了实时荧光PCR反应体系，该浓度下荧光强度较高，检测各基因的扩增效率最高(表2)。

1.4方法学验证与质量控制

利用筛选的最佳引物组合及三重实时荧光反应体系测定转基因玉米MON863、转基因玉米NK603、转基因玉米MON810、转基因玉米Bt11，非转基因玉米粉2019054以及转基因大豆粉，棉花籽和小麦粉等非玉米农作物样本等8份测试样品中的3个靶标基因，评价方法的特异性(表3)。所有的玉米样品中均获得adh1基因的指数型扩增曲线，且Ct值小于25，adh1基因检出；在转基因棉花281-24-236×3006-210-23，小麦粉2019079和转基因大豆GTS 40-3-2等非玉米农作物样本中无典型扩增曲线，adh1基因未检出；在转基因玉米MON863中外源基因p-35S、t-NOS的Ct值分别为29.24和30.21，均为检出(图1)；在转基因玉米Bt11外源基因p-35S、t-NOS的Ct值分别为27.90和 28.49，均为检出；在转基因玉米MON810中外源基因p-35S的Ct值为27.61，但t-NOS无荧光信号；在转基因大豆GTS 40-3-2，转基因棉花籽281-24-236×3006-210-23中p-35S和t-NOS均为检出；在非转基因玉米粉2019054中仅有adh1检出(图2)，以上信息均与待测样品信息相符；结果表明，本研究建立的三重实时荧光PCR检测方法可用于玉米转基因成分的筛查检测。

采用三重实时荧光PCR反应体系检测转基因玉米MON863基因组DNA 10倍系列梯度稀释液中的3个靶标基因。随着体系中转基因玉米基因组DNA浓度的降低，荧光信号逐渐减弱，Ct 值逐渐增加(表4)。当转基因玉米反应体系模板拷贝数低至10时，adh1、p-35S和t-NOS三种靶标基因均可获得S型扩增曲线，扩增效率分别为96.84%，94.92%和93.80%，定量曲线的R²分别为0.999，0.990和0.997。当反应体系模板拷贝数低至1拷贝时，荧光信号时有时无，较不稳定，难以判定是否为检出结果。结果表明该三重实时荧光PCR对转基因玉米基因组DNA的检测低限为10个拷贝。

在这项试验中，对51份玉米及其深加工制品进行转基因成分检测分析。其中包括实验室收集的转基因玉米标准品(Bt11, MON863, MON810, NK603)，CNAS组织发放的能力验证样品(T067-J273)，英国FAPAS组织发放的能力验证样品(GeMSU56A和GeMSU568)；来自不同农作物种子市场和互联网农作物销售商等10个玉米品系种子样本(晶甜3号, 中农甜488, 金甜玉808, 泰甜8号, 华珍, 珍甜6号, 金甜60, 珍早18, 甜糯3号, 加甜糯11号)，作为可种植的农作物活生物体代表。来自于农贸市场和超市的41份玉米食品，即罐装玉米(11批次)、玉米粉(20批次)、爆米花(10批次)，结果表明使用本研究建立的三重实时荧光PCR方法检测实验室收集的转基因标准品和阳性样本，检测结果与样本信息一致(表5)。使用三重实时荧光PCR检测10个玉米种子样本和41份玉米及其深加工制品样本结果与单重实时荧光PCR检测结果一致，均为阴性结果。

2讨论

转基因技术可实现单个的目标基因从一个生物体移植到另一个不相关物种的生物体中。2019年全球玉米总产量11.1×10⁸吨。中国对玉米进口实行配额制，且在2015~2020年间一直维持在7.2×10⁶吨。随着中国农业转基因技术研究和农产品贸易的快速发展，研究、试验、生产、加工、经营和进口环节的农业转基因生物种类不断增多，需强化研究试验源头、田间种植和进口加工环节监管，加强标识管理和科普宣传，切实履行《种子法》、《农业转基因生物安全管理条例》和《农业转基因生物标签的标识》，保障农业转基因生物研究与应用健康发展，保障公众知情权和选择权。

目前转基因成分的筛查检测主要有核酸水平和蛋白水平两种检测策略，前者主要有常规定性PCR、巢氏PCR、实时荧光PCR (Li, 2014; Koppel, 2014; Koppel, 2015)、数字PCR、基因芯片等依赖核酸序列的扩增或杂交技术，后者主要有酶联免疫吸附法、蛋白质印迹法、快速试纸法。蛋白水平检测灵敏度低，对深加工制品不能准确识别，有时会出现假阳性情况造成鉴定错误等情况影响检测结果，检测准确性不能满足监管要求。以常规PCR、巢氏PCR为主的PCR检测技术，由于要使用凝胶电泳进行产物分析，检测时间长，电泳染料还会带来环境污染；目前常用到的实时荧光PCR法多是对单个基因进行检测，通量低，多样品多基因检测时操作复杂，试剂成本较高。急需一种准确高效、简易可行、高通量的转基因成分识别和检测技术，保障食品农产品安全和转基因产业良性发展。

本研究按照多重荧光探针的特点，经特异性验证，无非特异性扩增等。本研究以转基因玉米常见的转基因元件为靶标基因，借助多个软件设计了在一个反应管中检测三个靶标基因的探针，并用不同的报告基团进行标记，以单拷贝玉米内源基因为内参照基因进行质控，通过了退火温度梯度，不同靶标引物和探针浓度的优化实验，开发了在同一个反应体系中能一次性检测三个靶标基因的玉米转基因成分多重实时荧光PCR检测方法，并经过同一反应系统中设置阳性对照、阴性对照和空白对照、重复实验等质量控制以及方法特异性、灵敏性和适用性等方法学验证实验。该实验方法确保同时检测的各靶标基因之间无信号干扰，扩增效率在90~110%之间，实验复孔之间的重复性较小，检测低限为每个反应10个拷贝。从样品提取到结果报告不超过2 h，简单易行，节约成本，适用于大量样品的检测，可用于玉米及其深加工制品中转基因成分的全程监测和快速监控，确保食品安全有重要意义。

3材料与方法

3.1材料

MON863转基因玉米标准品，深圳安莱尔科技公司；已知转基因阳性和转基因阴性样品均为CNAS/英国FAPAS能力验证样品，转基因玉米NK603由新疆海关技术中心馈赠，转基因西红柿由华中农业大学和中国农业大学馈赠；玉米及其深加工产品等样品购自于杭州。

3.2试剂

植物DNA快速提取试剂盒(NEP023)购自北京鼎国公司；深加工食品DNA提取试剂盒(DP326)购自天根生化科技公司；AceQ^®qPCR Probe Master Mix购自南京诺唯赞生物科技公司；探针与引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

3.3总DNA提取

称取干重样品40 mg或湿重样品150 mg，按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，非粉末样品加入DNA裂解液后使用手持式微量组织匀浆器(PB100)进行乳化均质，其中洗脱液使用灭菌双纯水100 µL。玉米粉等样品采用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(NEP023)进行DNA提取，玉米深加工制品采用深加工食品DNA提取试剂盒(DP326)进行操作。提取后的样品经质量评估合格后置于-20 ℃保存备用。

3.4引物和探针设计

根据前期研究的情况，选定p-35S、t-NOS以及adh1作为玉米物种的内参照基因。使用express 3.0软件设计引物和荧光探针，其中根据发射波长范围和设备检测通道的配置，选取FAM、HEX和TAMR为报告基团，使用非荧光淬灭基团进行荧光信号收集。

3.5三重实时荧光PCR反应

在无DNA酶的PCR反应管加入AceQ^®qPCR Probe Master Mix 10 µL，Passsive Reference Dye II(50×) 0.4 µL，3组检测引物和探针(用灭菌蒸馏水预先稀释为10 µmol/L)以及待测样品DNA溶液等扩增反应试剂，补足蒸馏水至20 µL。在ABI QuantStudio Q5实时荧光PCR仪设置扩增体系为94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，55~60 ℃退火延伸30s并采集信号，共40个循环反应。每个基因设置3个复孔，每次检测设置以MON863转基因玉米DNA为阳性对照，以2019054非转基因玉米粉DNA为阴性对照，以及无模板DNA的空白对照。

3.6方法学验证及质量控制

以转基因玉米MON863、NK603、MON810、Bt11，非转基因玉米粉2019054以及转基因大豆粉，棉花籽和小麦粉等非玉米农作物样本等8份测试样品的基因组DNA为模板，以灭菌蒸馏水为非模板空白对照，按照3.5中三重荧光定量PCR体系进行扩增反应，验证在一个反应管中各基因之间是否会有荧光信号干扰，空白对照中是否有引物二聚体或者探针与引物形成的交联结构的扩增信号。

以MON863转基因玉米样本基因组DNA为模板，用灭菌蒸馏水按照10倍浓度稀释成5个梯度。对5个梯度的标准品分别进行三重实时荧光PCR扩增，每个浓度设置3个重复，测试方法的扩增效率，线性关系，反应重复性以及方法的灵敏性。以反应体系中模板所含拷贝数的自然对数值为横坐标，以循环数为纵坐标绘制p-35S、t-NOS外源基因和adh1内源基因的标准曲线。

将购自于不同农作物种子市场和互联网农作物销售商的10个玉米品系种子样本，来自于农贸市场和超市的41份玉米食品以及实验室收集的各种转基因阳性样品进行三重实时荧光PCR扩增，验证方法的适用性。

作者贡献

王凤军是本研究的项目负责人，主要负责实验设计，试验方法开发，数据分析以及论文修改等工作；陈强和许海峰负责方法学验证试验，试验数据汇总与初步分析以及论文初稿撰写等工作。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由浙江省基础公益研究计划项目(LGC19C200007)、浙江经贸职业技术学院省属高校基本科研业务费项目(20SBYB03)和浙江省教育厅一般科研项目(Y201840745)共同资助。

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