水稻(Oryza sativa L.)是最重要的谷类作物，中国是世界上最大的生产国。2009年11月27日，中国农业部(MOA)对两个转基因水稻品种恢复系Bt Hua hui 1和杂交水稻系Bt Shan you-63颁发了转基因生物安全证书，表明了转基因水稻在我国生产试验的开始(clive, 2010)。

对于较早农杆菌介导法转化粳稻愈伤组织的报道见于1994年，由Hiei等完成。2006年，Seiichi Toki等使用日本晴成熟胚在愈伤诱导培养基中只培养1 d后就使用农杆菌浸染，最终，30余天就获得了转基因植株。在国内，苏益等(2008年)也使用同样的方法在40 d左右就得到了阳性T₀代水稻植株。他们的研究证明了农杆菌介导的水稻快速遗传转化方法是可行的。

在农杆菌介导水稻遗传转化的操作中，良好的愈伤组织状态一直是影响遗传转化效率的关键因素之一。围绕这一因素，研究者们研究了胚乳量、光照培养、干燥方式等对愈伤组织分化率的影响，本研究综合了前人的一些研究工作，加入了单蒸水浸泡成熟胚、去除胚乳(林拥军等, 1996)、光照培养(段承俐等, 2005)、干燥处理方式(Masayoshi et al., 1992)，去除继代培养(Seiichi Toki, 2006)，目的旨在根癌农杆菌介导水稻成熟胚愈伤组织的转化过程中提高愈伤组织诱导率与分化率，并最终在较短时间内获得水稻转化植株。

1结果与分析
1.1光照培养、暗培养对愈伤组织分化率的影响
光照培养和暗培养的愈伤分化率如图1所示，两个品种在光照培养和暗培养条件下愈伤分化率的差异极显著(<0.01)，说明光照培养对愈伤组织分化率具有促进作用。实验中发现，约3周的暗培养后，两品种的愈伤组织色泽普遍较暗，很少有颗粒状、表面干燥愈伤出现。并且，愈伤分化率较低，约为18%和 21%。在3周的光照培养后，生长出的愈伤组织从色泽、大小等均表现为较整齐的状态。

图1 暗培养与光培养对愈伤组织分化率的影响 Figure 1 Effect of different light culture coditions on the rate of callus differentiation

1.2干燥处理对愈伤组织分化率的影响
粳稻愈伤组织经过适当脱水处理能促进植株再生(Masayoshi, 1992)。侵染过后，愈伤组织的含水量较高，之后愈伤组织易褐化，导致分化率降低。而分化率是直接影响整个体系转化率的因素之一。所以，尽可能提高愈伤组织的分化率就显得十分必要。实验以固定干燥时间，探寻侵染后与共培养后干燥处理对愈伤组织分化率的影响。经过干燥处理后的愈伤组织分化率如图2所示。进行多重比较得知，台北309和日本晴的愈伤组织分化率在四种处理方式间差异显著。而在侵染后和共培养后都经过干燥处理能获得较高的愈伤分化率。(图3)

图2 干燥处理对愈伤组织分化率的影响 Figure 2 Effect of dehydration treatment on the rate of callus differentiation

图3 除草剂筛选愈伤组织和植株再生 Figure 3 Selection of phosphinothricin-resistant callus and plant regeneration

1.3水稻抗性植株的GUS组织化学染色和基因组PCR检测
对水稻抗性植株的叶片及根进行GUS组织化学染色检测，发现叶片与根均出现明显蓝色，而对照无任何蓝色斑点出现(图4)。在约370株抗性植株中选取其中一株转化水稻植株DNA为模板进行PCR扩增，得到一条约875 bp的条带，与目标条带大小一致，而非转基因对照植株没有扩增出此条带(图5)。

图4 转基因植株的GUS组织化学检测 Figure 4 GUS active transgenic plant by histochemical staining

图5 转基因植株的PCR检测 Figure 5 The transgenic plant identified by PCR

2讨论
对于水稻遗传转化，理想转化材料是幼胚，但获取幼胚受季节、地域、操作耗时和设施等影响较大。而成熟胚有来源不受限制、操作简便的优点。因此，在水稻遗传转化中使用较为普遍。

关于使用单蒸水浸泡和去除胚乳处理，林拥军等(1996)认为水稻成熟种子内部具有一套休眠的具缓冲作用的调节系统。去除水稻成熟种子的胚乳部分，则打破了该系统的稳定缓冲能力，进而吸收培养基中高量生长素，促使其系统内各细胞脱分化为愈伤组织。使用单蒸水浸泡，可能是促进成熟种子系统内各细胞从原有的休眠状态恢复到积极的分化状态。另外，笔者认为也有可能是使用升汞消毒后汞对外植体造成了一定的毒害，到后期会影响外植体的愈伤诱导，使用单蒸水浸泡和去除胚乳处理后，外植体的毒害程度降低，愈伤诱导率得到了提高。

分化前的光照培养是提高愈伤组织分化率的方法之一(段承俐等, 2001)。本实验的遗传转化过程中除去了继代步骤，而且研究也发现愈伤组织经过继代会降低其分化率。最终结果证明除去继代步骤在短时间内也可获得转化植株。侵染前愈伤组织最好选取颜色鲜黄、呈颗粒状、表面干燥的胚性愈伤组织，并且培养皿内已有个别愈伤产生了绿点。这样的愈伤组织胚性很好，很易分化。

饥饿处理和轻微失水等干燥处理有利于愈伤组织分化(鲁玉柱等, 2008; Masayoshi et al., 1992)，该过程中可能引起了愈伤细胞的一些生理、生化变化，促进对外源激素的吸收。采用在超净工作台内风干时间不宜过长，应根据愈伤组织状态而定，时间最好控制在30分钟以内，因为在此环境中愈伤的脱水速度很快，时间稍长，绝大部分愈伤就会因失水死亡。另外，有报道显示，在培养基的内部形成高渗环境也能对水稻愈伤组织进行有效的干燥。比如，通过提高培养基琼脂糖浓度、加人一定浓度的甘露醇、山梨糖醇等。

本研究使用的选择标记Bar基因来自土壤吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopieus )，编码膦丝菌素乙酰转移酶(Phosp-hoinothricin)，乙酰转移酶在植物的氮代谢过程中抑制谷氨酞胺合成酶的活性，破坏植物的光合作用，导致植物氨积累，最终中毒死亡(赵彬等, 1999)，而谷氨酰胺(Gln)会抑制乙酰转移酶的作用方式。所以，在筛选培养基中谷氨酰胺应当除去。筛选阶段选择在绝大部分愈伤出现绿点后筛选。

3材料与方法
3.1植物及细菌培养基
实验所用材料台北309和日本晴均种植于贵州大学转基因植物试验示范基地温室中。植物培养基根据文献报道进行部分改动(林拥军等, 2008; 向阳等, 2004; 余婧等, 2008)。改动为重悬液加入了36 g/L的葡萄糖，灭菌方式为：高温高压121℃，15分钟(表1)。

表1 培养基成分 Table 1 The composition of culture medium used in this study

3.2农杆菌菌株、质粒
单子叶植物表达质粒pCAMBIA0390的T-DNA区含玉米泛素启动子Ubi1启动筛选报告融合基因Bar::GUS。水稻肌动蛋白启动子Actin1驱动的Bt功能基因和终止子序列nos。LF分别为重组酶Cre和Flp的识别位点loxp和frt，该位点可被FLP识别，并将其间的外源基因定点删除(赵德刚等, 2008; 罗克明等, 2005)。其T-DNA区域见图6。

图6 质粒pCAMBIA0390的T-DNA区结构 Figure 6 The T-DNA Region of plasmid pCAMBIA0390

3.3外植体的获得和愈伤组织诱导
实验采用台北309、日本晴成熟胚作为愈伤组织诱导的外植体。将成熟种子去掉颍壳，除去色泽不正常的种子，消毒处理方法为75%酒精消毒1 min，0.1% HgCl₂消毒10 min，之后单蒸水涮洗5至6次。

外植体消毒后使用无菌单蒸水浸泡8-12小时，然后切除胚乳，接种于愈伤诱导培养基上。浸泡时单蒸水与外植体体积比约为4：1 (每次处理50个水稻外植体, 一共处理250个, 除去污染愈伤组织, 只统计200个水稻外植体的愈伤诱导率, 愈伤诱导率(%)=出愈胚数/接种幼胚数×100%)。

3.4光照培养条件
28℃ 暗培养，约3至4天长出芽，用解剖刀将芽完全切去，再将成熟胚接至愈伤组织诱导培养基，然后采用下面方式处理：(1)28℃、21 d的光照培养，光照强度为2000 lux，13 h/d。(2)28℃、21 d的暗培养(每次处理50个愈伤组织, 一共处理250个, 除去污染愈伤组织, 只统计200个愈伤组织的分化率, 愈伤分化率(%)=长出芽的愈伤数/愈伤组织总数×100%)。

3.5愈伤组织饥饿处理及侵染
在侵染开始前，将愈伤组织进行饥饿处理(鲁玉柱等, 2008)。将经过饥饿处理的愈伤组织置于农杆菌菌液中(OD₆₀₀≈0.4)侵染15 min，侵染完后倒出愈伤组织并用干燥无菌纸吸去多余菌液。

3.6侵染后与共培养后干燥处理
侵染后对愈伤组织进行如下处理：A组：不经过干燥处理，直接进行共培养，然后进行分化培养。B组：侵染后进行干燥处理。干燥处理方式为：在超净工作台内，将愈伤组织置于吸水纸上风干20分钟。共培养时在共培养基上垫一张滤纸，再将愈伤组织置于滤纸上(Hamid Rashid et al., 1996)，28℃暗培养3 d。共培养后使用甘露醇溶液冲洗4-5次至清亮(甘露醇0.1 mol/L, 内含头孢噻肟钠Cef 300 mg/L)。共培养后对愈伤组织进行如下处理：C组：对侵染后未经干燥处理的愈伤组织进行干燥处理。D组：对侵染后经干燥处理的愈伤组织进行干燥处理。干燥处理方式为：风干20分钟，再将愈伤组织置于垫有2层吸水纸的培养皿中，光照条件下干燥8小时(每次处理50个愈伤组织, 一共处理250个, 除去污染愈伤组织, 只统计200个愈伤组织的分化率, 愈伤分化率(%)=长出芽的愈伤数/愈伤组织总数×100%)。

3.7愈伤组织分化及抗性植株的获得
将共培养后的愈伤组织接至分化培养基上进行约7 d的分化。光照条件为2 000 lux、13 h/d，温度26℃。然后进入约14 d的筛选分化，将获得的抗性苗转移至生根培养基中。约14 d后，将根系发育良好的再生水稻植株炼苗、移栽。

3.8转基因水稻的GUS组织化学检测
具体方法参照Jefferson方法(1987)所述。

3.9基因组PCR检测
提取除草剂抗性水稻植株的基因组DNA(TIANGEN公司的植物基因组提取试剂盒提取)。根据UbiI启动子序列，设计合成一对引物，上游引物序列为：5’-CATCTCTGTCGCTGCCTCTG-3’，下游引物序列为：3’-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAA-5’。PCR反应体系为25 µl，上下游引物各1.5 µl，2 µl Template DNA，2.5 µl 10×EX Taq buffer，4 µl dNTPs (2.5 mM, Mg²⁺plus)，0.15 µl TaKaRa EX Taq DNA聚合酶，11.35 µl ddH₂O。PCR扩增程序为：94℃变性2分钟，94℃ 30秒，55℃ 40秒，72℃ 40秒，35个循环；72℃延伸3分钟，4℃保存。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

3.10统计分析
实验数据使用统计软件SPSS 13.0作差异显著性分析，采用LSD法作多重比较分析。

作者贡献
赵德刚是项目的构思者及负责人，指导实验设计和论文写作与修改。郭刚参与本研究实验设计、实验研究、数据分析、论文初稿的写作和试验结果分析。余靖参与完成研究中载体设计。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由科技部国际科技合作项目：基因删除技术在转基因水稻和油菜上的应用及安全性评价(项目编号: 2007DFA31260)；科技部国家科技支撑计划项目：喀斯特山区特有作物优异基因资源发掘与转基因安全关键技术研究与应用(项目编号: 2007BAD59B06)；科技部国家科技支撑计划项目：国家转基因新品种培育重大专项-安全转基因技术研究(项目编号: 2008ZX08010-003)资助。

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