Cloning and Expression Analysis of CsPI Gene from cucumber

Zhang Weiwei　She Weiwei　Xu Fei　Zhou Peng　Gao Dongju *　Cheng Wenjing *

Department of Plant Science and Technology, Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry, Shanghai, 201699

* Corresponding authors, gaodj@shafc.edu.cn; chengwj@shafc.edu.cn

Abstract　MADS-box family genes play an important role in the development of plant floral organs. The cDNA sequence of B-class MADS-box gene CsPI involved in flower development were isolated from the apical bud of cucumber (cucumis sativus L.) by homology cloning. Open reading frame (ORF) of CsPI was 636 bp, encoding 211 amino acids. Molecular weight of CsPI was 24 904, and the theoretical isoelectric point was 8.42. Molecular phylogeny analysis and protein sequence alignment suggested that CsPI was grouped with the PI lineage, and C domain of CsPI was contained a conserved PI motif. Sequences of cucurbitaceae PI homologous proteins were relatively conservative. Among them, CsPI had the highest homology with melon CmPI, which was 98.6%. Quantitative real-time PCR showed that the CsPI gene was mainly expressed in petals and stamens of floral organs. This study provides a theoretical basis for studying the development of cucumber floral organs.

Keywords　Cucumber; PISTILLATA (PI) ; Gene; Cloning; flower

花是被子植物特有的性状，在植物生命繁衍中发挥着重要的作用(Thorne, 1992)。一朵典型的花通常包含四轮器官，由外向内分别是：萼片，花瓣，雄蕊和雌蕊。通过对模式植物拟南芥和金鱼草同源异型突变体的研究，Coen and Meyerowitz于1991年提出了经典的花发育“ABC”模型，这个模型提出，A类基因在第一和第二轮发挥作用，B类基因在第二轮和第三轮发挥作用，C类基因在第三轮和第四轮发挥作用(Litt and Kramer, 2010)。A类和C类基因相互拮抗，即如果A类基因发生突变，C类基因便会在第一和第二轮表达，突变体的花由外向内依次是心皮、雄蕊、雄蕊、心皮。C类基因突变后，A类基因便会在第三和第四轮表达，突变体的花器官分别是萼片、花瓣、花瓣和萼片。B类基因的突变体的花器官分别是萼片、萼片、心皮和心皮(Coen and Meyerowitz, 1991; Litt and Kramer, 2010)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，B类基因包括APETALA3 (AP3)和PISTILLATA (PI)。ABC模型被提出后，研究者又在矮牵牛(Petunia×hybrida)中发现了控制胚珠发育的D类基因FBP7和FBP11 (Angenent and Colombo, 1996; Irish, 2010)。之后，发现了参与所有花器官发育的E类基因SEPALLATA1/2/3/4 (SEP1/2/3/4) (Ditta et al., 2004)。至此，ABC模型补充发展为ABCDE模型。

黄瓜(Cucumis sativus L.)，又称王瓜、胡瓜，属于葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis)是世界上普遍栽培的重要蔬菜作物之一(李怀智, 2003; 安志信等, 2006)。因此，研究黄瓜花器官的发育具有重要意义，相关研究近年来也不断增加。Sun等通过同源克隆研究了黄瓜B类基因CsAP3，CsAP3在雄花芽的花瓣和雄蕊中高表达，在拟南芥ap3突变体中过表达CsAP3可以互补ap3的表型(Sun et al., 2016)。黄瓜CUM1是拟南芥C类基因AG的同源基因，原味杂交显示CUM1在雄蕊和胚珠中表达(Gu et al., 2018)。黄瓜芒果瓜突变体(mango fruit (mf))的叶片和花瓣不正常分裂，雄蕊和雌蕊育性下降，图位克隆发现MF编码一个WUSCHEL-related homeobox (WOX)转录因子。黄瓜CsUFO编码一个F-box蛋白，该基因突变后花器官发育异常，卷须前端也发育成“叶片”(Chen et al., 2021)。尽管关于黄瓜花器官发育的研究报道较多，但迄今为止，关于B类基因PI的研究在黄瓜中未见报道。本研究利用同源克隆从黄瓜cDNA中克隆CsPI基因，基于生物信息学对其进行分析，并通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)分析该基因的时空表达模式，初步分析其在黄瓜花发育过程中分子机制，为今后深入研究该基因功能提供一定基础。

1结果与分析

1.1 RNA提取与基因克隆

通过同源比对，发现拟南芥PI在黄瓜中同源性最高的基因是CsaV3_4G028010，将其命名为CsPI。使用设计好的引物对CsPI编码区全长进行扩增，1.0%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，出现单一的DNA条带(图1)。将CsPI编码区片段与克隆载体连接转化后进行菌落PCR的鉴定。测序后发现CsPI全长636 bp，编码211个氨基酸，其分子质量为24 904，理论等电点为8.42。

1.2 CsPI的同源性分析及系统发育树构建

将黄瓜的CsPI的蛋白序列与其他植物的PI蛋白序列进行相似性比对，结果发现，黄瓜CsPI与拟南芥的PI、猕猴桃(Actinidia chinensis)的AcPI、云南木鳖(Momordica dioica)的MdPI、美洲南瓜(Cucurbita pepo)的CpPI、冬瓜(Benincasa hispida)的BHPI、苦瓜(Momordica charantia)的McPI和甜瓜(Cucumis melo)的CmPI蛋白序列同源性分别为60.8%、79.7%、84.3%、93.9、95.8%、97.2%和98.6% (图2)。这些PI蛋白序列在N端均包含MADS结构域，在C端含有保守的PI基序。

为了分析黄瓜的CsPI的系统发育，利用CsPI的蛋白序列与其他植物花器官发育的蛋白序列构建了系统进化树。结果表明，ABCDE模型中不同类型的基因聚为不同的分支，B类基因分为AP3和PI两个分支，其中黄瓜的CsPI与拟南芥的PI、猕猴桃的AcPI、云南木鳖的MdPI、苦瓜的McPI、甜瓜的CmPI、美洲南瓜的CpPI、中国南瓜的CmmPI、印度南瓜的CmaPI和、冬瓜的BhPI等聚为同一分支。这些都说明CsPI属于B类基因PI的同源基因，且葫芦科的PI基因相对比较保守(图3)。

1.3 CsPI的表达模式

以特异引物RT-CsPIF和RT-CsPIR检测CsPI基因在黄瓜不同组织中的表达情况(图4)。结果表明，4片真叶时，CsPI基因主要在黄瓜顶芽中表达，茎中次之，在其他营养器官中根、叶、子叶和卷须中表达量均比较低。在花器官中，CsPI主要在花瓣和雄蕊中表达，这与B类基因的功能相一致(Goto and Meyerowitz, 1994)。

2讨论

本研究通过同源克隆获得了黄瓜B类MADS-box基因CsPI，序列同源性显示，CsPI与葫芦科其他物种的PI蛋白同源性较高，C端包含保守的PI基序，并与聚为一类，说明CsPI在进化过程上相对比较保守。

在被子植物中，B类基因AP3和PI来源于相同的祖先。AP3和PI主要在第二轮和第三轮花器官中表达，控制花瓣和雄蕊的发育，但不同物种中其功能又有所差异。模式植物拟南芥的B类基因主要在花瓣和雄蕊中表达。但是，在部分单子叶植物中，花器官并不是典型的结构，即由萼片，花瓣，雄蕊和雌蕊组成。例如百合科植物，花的最外两轮几乎是完全相同的花瓣状器官，B类基因不仅在第二、三轮花器官中表达，而且也在第一轮花器官中表达(Van Tunen et al., 1993)。在洋葱(Allium cepa)中，AcPI基因在4轮花器官中均有表达(李洪有等, 2012)。番红花(Crocus sativus)的两个B类功能基因CsatAP3和CsatPI也在全部4轮花器官中也都表达(Tsaftaris et al., 2006)。在大花蕙兰(Cymbidium hybrid)中，AP3类基因ChMADS1在子房以及所有花器官中都表达(陈小强等., 2008)。Hsu等通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术，发现B类基因参与了文心兰(Oncidium hybridum)和蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)萼片和花瓣的发育。在这些单子叶植物中，B类基因的表达部位发生了变化，其功能也发生了相应改变。而通过RT-PCR和原位杂交实验，发现黄瓜的CsAP3主要在花瓣和雄蕊中表达(Sun et al., 2016)，本研究的CsPI也在主要在花瓣和雄蕊中表达，与模式植物拟南芥的PI基因表达类似。这说明黄瓜的B类基因功能比较保守，可能主要参与花瓣和雄蕊的发育。

在拟南芥中，B类基因的表达依赖LFY和UFO的互作来激活。Zhao等通过同源克隆黄瓜的CsLFY基因，同样发现CsLFY可以和CsUFO互作调控CsAP3的表达，CsLFY-RNAi转基因植株CsAP3的表达水平显著下调(Zhao et al., 2018)。另外，Chen等通过图位克隆获得了黄瓜CsUFO基因，该基因突变后黄瓜花瓣变成叶片状，突变体中CsAP3和CsPI的表达水平都明显降低(Chen et al., 2021)，这说明黄瓜B类基因同样可能受CsLFY和CsUFO的调控。本研究初步揭示了CsPI的功能，但后续还需要通过原位杂交、转基因等技术对其进行进一步探析。

3材料与方法

3.1实验材料与试剂

黄瓜自交系9930种植于上海农林职业技术学院五厍实训基地。全能型植物RNA提取试剂盒(DNase I)，反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit，实时荧光定量PCR试剂UltraSYBR Mixture均购买于康为世纪。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购买于天根生化科技有限公司，无缝克隆试剂盒pClone007 Blunt Simple Vector kit购买于擎科生物科技有限公司，DH5α克隆感受态细胞购买于上海唯地生物技术有限公司，引物合成与测序均在上海生工生物工程股份有限公司进行。

3.2基因的克隆与鉴定

在NCBI网站查询拟南芥PI序列，在黄瓜基因组网站(http://cucurbitgenomics.org/)上比对到黄瓜9930第三版基因组，找到同源性最高的基因，将其命名为CsPI。通过分析CsPI的基因序列，设计含有起始密码子的特异引物(CsPIF: 5'-ATGGGAAGAGGGAAAATAGAAATAA-3')和终止密码子的特异引物(CsPIR: 5'-TTATTCCCTTTCTTGTAGATTTGGCT-3')。以黄瓜顶芽cDNA为模板，CsPIF和CsPIR为引物，进行PCR扩增得到CsPI编码区片段。将经过电泳检测后的片段与pClone007 Blunt Vector克隆载体连接，转化入DH5α感受态细胞，经过菌落PCR筛选，选择阳性克隆送往上海生工进行测序。

3.3 CsPI的生物信息学分析

利用Expasy数据库的“Compute pI/Mw tool”功能计算CsPI的等电点与分子量。从NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)网站中下载植物花器官发育蛋白的序列(表1)，利用黄瓜的CsPI序列和其他物种的PI蛋白进行多序列比对，利用这些花器官发育蛋白序列使用MEGA X软件构建Neighbor Joining系统进化树。

3.4黄瓜CsPI的表达模式分析

为了分析CsPI基因在黄瓜不同组织中表达模式，对4片真叶时黄瓜植株的根、茎、嫩叶和顶芽进行取样，对20节位时植株的伸展开的卷须、开花当天雄花的萼片和花瓣、雌花开花当天的幼瓜进行取样，分别提取各个器官的总RNA，反转录成cDNA。然后以合成的cDNA为模板，黄瓜CsACTIN2 (Csa6G484600)基因为对照，用CsPI基因编码区的特异性引物RT-CsPIF (5'-CTAAGCATGAGAATCTGAGCAATG-3')和RT-CsPIR (5'-AGCCATTAACTCCTTGTAGTTCAA-3')，通过实时荧光定量PCR检测CsPI基因在黄瓜不同组织中的表达情况。使用CFX96 Touch™ Real-Time PCR System进行反应，所有样品进行三个生物学重复，三个技术重复，采用2^-△△Ct方法进行基因的相对表达量分析(Livak and Schmittgen, 2001)。

作者贡献

张微微是本研究实验设计者和实验研究执行人及负责人；佘为为及徐菲完成数据分析，论文初稿撰写；周鹏参与实验设计，试验结果分析；高东菊和成文竞指导论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由上海市“科技创新行动计划”农业领域项目(20392001300)、上海自然科学基金(20ZR1439600)、上海农林职业技术学院中青年领军人才项目(A2-0273-20-01-16)和校内课题(KY2-0000-20-01)项目资助。

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