Cloning and Expression Model of CsAP2 Gene from Cucumber

Zhang Weiwei ¹　Cheng Wenjing ¹　Zhang Qin ¹　Xu Taibai ¹　Bao Wenmin ²*　Wang Huan ¹*

1 Department of Plant Science and Technology, Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry, Shanghai, 201699; 2 Department of Plant Science and Technology, Shanghai College of Agriculture, Shanghai,201699

* Co-corresponding authors, wangh@shafc.edu.cn; baowm@shafc.edu.cn

Abstract　cDNA sequence of CsAP2 involved in flower development was isolated from the apical bud of cucumber (Cucumis sativus L) by homology cloning. Open reading frame (ORF) of CsAP2 was 1 452 bp, encoding 483 amino acids. Molecular weight of CsAP2 was 53 359, and the theoretical isoelectric point was 5.59. Phylogeny analysis and protein sequence alignment suggested that CsAP2 grouped with the AP2 lineage, and had two highly conserved AP2 domains. CsAP2 had the highest homology with melon CmAP2, which was 97.7%. In addition, CsAP2 was located in the nucleus. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) showed that CsAP2 was expressed in vegetative organs and four-wheel floral organs.

Keywords　Cucumber; APETALA2 (AP2); gene; Cloning

花是被子植物特有的性状，在植物生命繁衍中发挥着重要的作用(Thorne, 1992)。一朵典型的花通常包含四轮器官，由外向内分别是：萼片，花瓣，雄蕊和雌蕊。通过对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和金鱼草(Antirrhinum majus)同源异型突变体的研究，Coen和Meyerowitz于1991年提出了经典的花发育“ABC”模型，这个模型提出，A类基因在第一和第二轮发挥作用，B类基因在第二轮和第三轮发挥作用，C类基因在第三轮和第四轮发挥作用(Litt and Kramer, 2010)。ABC模型被提出后，研究者又在矮牵牛(Petunia×hybrida)中发现了控制胚珠发育的D类基因FBP7和FBP11 (Angenent and Colombo, 1996; Irish, 2010)。之后，发现了参与所有花器官发育的E类基因SEPALLATA1/2/3/4 (SEP1/2/3/4) (Ditta et al., 2004)。至此，ABC模型补充发展为ABCDE模型。大多数ABCDE类基因都属于MADS-box家族基因，但A类基因APETALE2 (AP2)属于AP2/EREBP (APETALA2/ethylene-responsive element binding proteins)转录因子。AP2/EREBP型转录因子都包含一段高度保守的约70个氨基酸组成的序列，即AP2结构域。根据AP2结构域的数量，AP2/EREBP可以分为两个亚家族：AP2亚家族，包含两个AP2结构域；EREBP亚家族，包含一个AP2结构域(Weigel, 1995)。一般来说，AP2亚家族主要参与植物的生长发育，而EREBP亚家族基因主要参与对植物激素，病原菌侵染和环境胁迫的响应(Klucher et al., 1996; Liu et al., 1998; Dubouzet et al., 2003)。

黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界上普遍栽培的重要蔬菜作物之一(李怀智, 2003, 蔬菜, 8: 3-4.)。由于黄瓜性型种类多样，使它成了研究植物性别分化和器官发生的重要模式植物(Pan et al., 2018)，因此研究黄瓜花器官的发育具有重要意义。拟南芥AP2不仅参与花器官的发育，还参与花分生组织的身份的建立，在植物生长发育中至关重要(Weigel, 1995; Klucher et al., 1996)。目前，已经在矮牵牛、水稻(Oryza sativa)、牡丹(Paeonia suffruticosa)、苹果(Malus domestica)等植物中进行了研究(Maes et al., 2001; Zhao et al., 2006; 张计育等, 2012; 高燕等, 2013)。但迄今为止，AP2/EREBP类基因AP2的研究在黄瓜中未见报道。本研究对CsAP2基因进行了同源克隆与表达分析，这将为今后进一步研究该基因提供一定的理论基础。

1结果与分析

1.1 RNA提取与基因克隆

通过同源比对，发现拟南芥AP2在黄瓜中同源性最高的基因是Csa2G279250，将其命名为CsAP2。对CsAP2进行PCR扩增，凝胶电泳后出现单一的DNA条带(图1)。将CsAP2编码区片段与克隆载体连接转化后进行菌落PCR的鉴定。测序结果表明CsAP2编码区全长为1 452 bp，编码483个氨基酸，其分子质量为53 359，理论等电点为5.59。

图1 CsAP2基因cDNA的PCR扩增 注: M代表2 kb DNA Maker的分子量标准; 左侧数字单位是bp Figure 1 PCR amplification of CsAP2 cDNA Note: M refers to 2 kb DNA Maker; The unit of the number on the left is bp

1.2 CsAP2的同源性分析及系统发育树构建

将黄瓜的CsAP2的蛋白序列与其他植物的AP2蛋白序列进行相似性比对，结果发现(图2)，黄瓜CsAP2与拟南芥的AP2、冬瓜(Benincasa hispida)的BhAP2、甜瓜(Cucumis melo)的CmAP2、中国南瓜(Cucurbita moschata)的CmoAP2、美洲南瓜(Cucurbita pepo)的CpAP2、苦瓜(Momordica charantia)的McAP2和葡萄(Vitis vinifera)的VvAP2蛋白序列同源性分别为47.5%、89.4%、97.7%、72.0%、73.3%、74.7%和54.0%。这些AP2蛋白具有AP2亚家族的典型特征，即均含有两个保守的AP2结构域。

图2 不同植物中AP2同源蛋白的序列比对 Figure 2 Alignment of the AP2 homologous proteins from different plant species

为了进一步分析黄瓜的CsAP2的进化关系，利用CsAP2与其他36个花器官发育的蛋白序列构建了系统进化树。结果表明，ABCDE模型中不同类型的蛋白聚为不同的分支，A类基因分为AP1/FUL和AP2两个分支，黄瓜的CsAP2与甜瓜的CmAP2、冬瓜的BhAP2、中国南瓜的CmoAP2、美洲南瓜的CpAP2等聚为同一分支。这些都说明CsAP2属于A类基因AP2的同源基因，葫芦科的AP2基因相对比较保守，且黄瓜的CsAP2与甜瓜的CmAP2的亲缘关系最近(图3)。

图3 CsAP2蛋白与其他物种花器官发育蛋白的系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of CsAP2 and floral organ development proteins of other species

1.3 CsAP2定位在细胞核

为了研究CsAP2蛋白的亚细胞位置，选择YFP作为标记蛋白，构建了CaMV 35S::CsAP2-YFP载体。对烟草瞬时转化后，使用激光共聚焦显微镜进行观测(图4)。结果显示，对照YFP蛋白在烟草叶片表皮细胞的质膜、细胞核和细胞质中均有强烈表达。CsAP2-YFP融合蛋白定位于细胞核中，符合转录因子的典型特征。

图4 CsAP2的亚细胞定位 Figure 4 Subcellular localization analysis of the CsAP2 protein

1.4 CsAP2的表达模式

以特异引物RT-CsAP2F和RT-CsAP2R检测CsAP2基因在黄瓜不同器官中的表达情况(图5)。结果表明，4片真叶时，AP2基因在黄瓜叶片中的相对表达水平较高，其次是在顶芽、茎、叶和卷须中，在子叶中表达量最低。在花器官中，CsAP2主要在萼片中表达，但在花瓣、雄蕊、柱头和幼瓜中也均有表达。

图5 CsAP2基因营养器官(A)和花器官中(B)的表达模式 注: 不同小写字母表示样品间存在显著差异(P<0.05) Figure 5 Expression pattern of CsAP2 gene in vegetative organs (A) and floral organs (B) Note: Different lowercase letters indicate significant differences between samples (P<0.05)

2讨论

随着人类基因组测序完成，目前已经在拟南芥、水稻等植物中进行了全基因组测序。黄瓜作为一种重要的蔬菜作物，Huang等(2009)利用华北型品种9930完成了黄瓜全基因组测序。本研究基于黄瓜第二版参考基因组，通过同源克隆获得了黄瓜A类基因CsAP2，序列同源性显示，CsAP2与葫芦科其他物种的AP2蛋白同源性较高，且含有两个保守的AP2结构域，说明CsAP2属于AP2亚家族基因。

黄瓜和甜瓜起源于同一个祖先，通过共线性分析发现黄瓜7条染色体中的其中5条，即1，2，3，5和6号染色体，分别是由甜瓜12条染色体中的10条，即2/12，3/5，4/6，9/10，8/11号染色体两两融合而成(Huang et al., 2009)。本研究发现黄瓜的CsAP2与甜瓜的CmAP2同源性高达97.7%，这也符合黄瓜与甜瓜亲缘关系比较近的结论。

作为A类基因，AP2影响第一轮和第二轮花器官的发育。拟南芥ap2弱突变体导致萼片向“叶片状”器官转变，花瓣向雄蕊转变(Irish, 1998)。ap2强突变体第一轮和第二轮器官数目减少，且剩余第一轮器官转变为心皮，第二轮器官转变为雄蕊，这与A类基因的功能相符(Irish, 1998)。此外，AP2还参与胚珠和种子的发育(Jofuku et al., 1994)。水稻的OsAP2除了调控花器官的发育，还影响花粉活力和萌发活性(Maes et al., 2001)。玉米AP2-like基因ZmGL15参与叶片的形成(Moose and Sisco, 1996)。本研究通过定量分析，发现CsAP2在黄瓜营养器官和花器官中均有表达，这与拟南芥、水稻、苹果等植物中的表达情况一致(Jofuku et al., 1994; Zhao et al., 2006; 张计育等, 2012)，这些都说明了AP2-like基因功能比较广泛，可能在植物营养和生殖器官发育过程都非常重要。但后续还需要进一步通过原位杂交、转基因、酵母双杂交等实验进一步验证CsAP2的功能。

3材料与方法

3.1实验材料

黄瓜自交系9930种植于上海农林职业技术学院五厍实训基地。用于亚细胞定位的烟草(Nicotiana benthamiana)由上海交通大学农业与生物学院蔡润课题组提供。大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101购买于上海唯地生物技术有限公司

3.2基因的克隆与鉴定

在NCBI网站下载拟南芥AP2 (NP_001190938.1)序列，将该序列在黄瓜基因组网站(http://cucurbitgenomics.org/)比对到黄瓜9930第二版基因组，找到同源性最高的基因，将其命名为CsAP2。在CsAP2编码区设计特异引物CsAP2F (5'-ATGTGGGATCTCAATGATTCTCC-3')和CsAP2R (5'-TCAAGAGGGTCTCTGTAAGAAGAA-3')。以黄瓜顶芽cDNA为模板，用CsAP2F和CsAP2R进行PCR扩增，得到预期大小片段。将目的片段与pClone007 Blunt Vector克隆载体连接，转化入DH5α感受态细胞，经过菌落PCR筛选，选择阳性克隆送往上海生工进行测序。

3.3生物信息学分析

利用Expasy数据库的“Compute pI/Mw tool”功能对CsAP2的等电点与分子量进行预测。从NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)网站中下载植物的花器官发育蛋白的序列(表1)。利用黄瓜的CsAP2序列和其他物种的AP2蛋白进行多序列比对，利用这些花器官发育蛋白序列使用MEGA X软件构建Neighbor Joining系统进化树。挑选AP2序列利用DNAMAN软件进行多序列比对。

表1 系统进化树和多序列比对所用的蛋白 Table 1 Proteins used in phylogenetic analysis and multiple sequence alignment

3.4亚细胞定位

将CsAP2基因去掉终止密码子后连接到含黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)基因的pHB载体，酶切位点为BamH Ⅰ和Spe Ⅰ。构建CaMV 35S::CsAP2-YFP融合载体，将载体转入到农杆菌GV3101中。按照Schöb等报道的方法注射本氏烟草(Schöb et al., 1997)。暗培养36 h后在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5II)观察荧光信号，拍照。

3.5黄瓜CsAP2的表达模式

在黄瓜生长至4片真叶时，取植株的根、茎、嫩叶、子叶和顶芽。待黄瓜生长至20节位时，取植株的伸展开的卷须、开花当天雄花的萼片和花瓣、雌花开花当天的柱头和幼瓜，分别提取各个器官的总RNA，反转录成cDNA。根据CsAP2基因编码区序列，设计特异性引物RT-CsAP2F (5'-GGATCTCAATGATTCTCCTGATCA-3')和RT-CsAP2R (5'-CTCGAGTTAGAATTAATGGACCCT-3')，通过qRT-PCR实验检测CsAP2基因在黄瓜不同器官中的表达情况。黄瓜CsACTIN2 (Csa6G484600)基因为对照。全能型植物RNA提取试剂盒(DNase I)，反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit，实时荧光定量PCR试剂UltraSYBR Mixture均购买于康为世纪。使用CFX96 Touch™ Real-Time PCR System进行反应，所有样品进行三个生物学重复和三个技术重复，采用2^-△△Ct方法进行基因的相对表达量分析(Livak and Schmittgen, 2001)。

作者贡献

张微微是本研究实验设计者和实验研究执行人及负责人，论文撰写；成文竞及张琴完成数据分析；许太白和鲍文敏参与实验设计，试验结果分析；王欢指导论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由上海市“科技创新行动计划”农业领域项目(20392001300)、上海自然科学基金(20ZR1439600、19ZR1436500)、上海农林职业技术学院中青年领军人才项目(A2-0273-20-01-16)和校内课题(KY2-0000-20-01)项目资助。

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