Bioinformatics Analysis of smHsp and Heat Shock Induced Its Expression in Volvariella volvacea under Low Temperature Stress

Yu Changxia　Yang Huanling　Zhao Yan ^*　Huang Jinli　Li Zhengpeng　Zha Lei　Dong Qin　Chen Mingjie ^*

Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture, P. R. China, National Engineering Research Center of Edible Fungi, National Engineering Research Center for Edible Fungi, Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai, Shanghai, 201403

* Co-corresponding authors, jiandan289@126.com; mjfungi@126.com

Abstract　Heat shock proteins (HSPs) is one of the important proteins in organism to protect against cellular damage caused by environmental stress. Heat treatment is the main factor that induced heat shock protein production. smHsp is one of the HSPs, which are often induced by heat treatment and can be overexpressed. Bioinformatics analysis of smHsp gene was performed in Volvariella volvacea. The strain V23 (cold-sensitive) and VH3 (cold-tolerant) of V. volvacea were selected as experimental materials. Relative expression of smHsp gene under low temperature stress in mycelia of the two strains after being treated at 40 ℃ for 2 h was also determined. Results showed that the smHsp gene of V. volvacea is located in the cytoplasm. This protein has no signal peptides and transmembrane structure, belongs to the Hsp20 superfamily, and has near relationships with Pholiota nameko. The heat treatment increased the relative expression of smHsp gene under low temperature stress in V23 and VH3. It’s concluded that heat treatment may be helpful for the adaptation of V. volvacea to low temperature stress.

Keywords　Heat shocks; Low temperature; smHsp; Bioinformatics; Induced expression

草菇(Volvariella volvacea (Bull.) Singer)，是最具中国特色的传统食用菌品种之一，原产于中国热带、亚热带地区。草菇属于高温型食用菌，其菌丝最适生长温度为32~35 ℃，子实体分化发育的适宜温度为27~31 ℃ (邓优锦等, 2011)。在0~4 ℃的低温条件下，草菇组织结构易被破坏，膜质过氧化作用增强，细胞膜通透性加强，菌丝或子实体出现变软、液化等低温自溶现象(乔娜, 2008)。因此，低温胁迫是草菇品质下降和产量降低的重要非生物胁迫因子之一，严重影响其采后保鲜及菌种保藏。

0 ℃以上的低温对植物造成的伤害称为冷害，其主要表现为生物体细胞膜结构受到损伤，大量胞内可溶性物质外渗，对物质的选择性交换功能随之下降，细胞渗透压稳定性受到严重影响(李美茹等, 2000)。研究表明，热激处理不仅可以提高植物耐热能力，而且可以提高其耐冷性(Porat et al., 2000)，如番茄(Solanum lycopersicum)幼苗经过44 ℃、2 h的热激处理后其抗冷性明显增加(王明明等, 2001)；热激处理可以有效提高苦瓜(Momordica charantia L.)采后抗冷性，延长保鲜期(董华强等, 2005)；热激处理能提高草莓(Fragaria×ananasa Duch.)、石榴(Punica granatum L.)、豇豆(Vigna unguiculata (Linn.) Walp)等果蔬的抗冷性(Chen et al., 1986; Vicente et al., 2006; Mirdehghan et al., 2007)。短时间的热激处理也能更好地保持果蔬的采后贮藏品质(Aghdam and Bodbodak, 2014)。

生物体在受到高温胁迫(热激)时，迅速诱导合成热激蛋白(heat shock poretins, HSPs) (Lindquist and Craig, 1988)。在真核生物中，根据分子量大小热激蛋白可分为smHsp、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp100等家族(Vierling, 1991)。热激蛋白在生物体内一方面担当分子伴侣，参与新生肽链的折叠、寡聚蛋白质的组装和蛋白质的跨膜运输，另一方面参与逆境损伤蛋白的修复和降解(Lindquist and Craig, 1988; Vierling, 1991)。已有研究结果表明，热激诱导合成的特定热激蛋白与耐冷性相关，对萌发的水稻(Oryza sativa L.)种子进行42 ℃热激处理后其幼苗的耐冷性明显增强，检测到9种热激诱导合成的Hsp，其中仅属于Hsp70的内质网结合蛋白(BiP)的合成与水稻幼苗耐寒性的提高有关(黄上志等, 2004)。用³⁵S-甲硫氨酸标记刚采摘的番茄果实，在38 ℃热处理48 h的果实中检测到高含量的带放射性标记的特定蛋白，这些蛋白在果实置于2 ℃下冷藏21 d后仍可检测到；但在热处理后置于20 ℃下4 d的果实中，检测到的带标记的蛋白含量急剧减少，且这样的果实对冷害敏感，表明热激蛋白与耐冷性之间具有持久性(Sabehat et al., 1996)。

目前，真菌中Hsp的研究主要集中于探讨Hsp的诱导合成有助于提高其耐热性方面，如耐热酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株HU-TY-1的高耐热性与Hsp72和Hsp84的组成性合成密切相关(金承涛等, 2001)；真姬菇(Hypsizygus marmoreus) Hsp70基因转化子的热激蛋白表达量提高，其对高温的应激性也随之增强(姜辉, 2011)；热激蛋白Hss1和Hsp70对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)耐高温可能有重要作用(陆兆明, 2008)。关于热激诱导真菌合成Hsp提高其耐冷性的研究少见报道。本课题组前期针对草菇开展的相关组学分析结果表明，草菇低温表达差异基因主要富集在碳代谢、能量代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢途径，并发现热激有利于低温胁迫后草菇菌丝的恢复生长(黄金丽, 2017)。本实验通过热激诱导草菇菌丝合成热激蛋白，选取该蛋白smHsp基因，比较了经过热激处理与未经热激处理的草菇菌株在进行不同时间的低温胁迫后smHsp基因相对表达量变化，为解析草菇低温自溶机理和开展草菇耐冷特性种质改良提供理论依据。

1结果与分析

1.1草菇smHsp生物信息学

编码草菇smHsp的氨基酸数为146个，理论分子量为16.45 kD，理论等电点为5.12，半衰期为30 h，不稳定指数(instability index)为58.92，属于非稳定性蛋白。脂肪系数(aliphatic index)为66.85，亲水性(grand average of hydropathicity, GRAVY)的平均水平为-0.599，进一步说明其为非稳定性蛋白。该蛋白不存在信号肽，不属于分泌蛋白。使用在线分析软件进行亚细胞定位，结果显示该蛋白不是位于线粒体上，进一步访问PSORTB服务器(http://www.psort.org/psortb/)显示：草菇smHsp蛋白的主要功能场所是在细胞质、细胞质膜、周质和胞外，可以确定其在细胞质内发挥生物学作用。通过跨膜结构预测，草菇smHsp蛋白不存在跨膜结构，因此该蛋白不属于跨膜蛋白。对该蛋白的磷酸化位点进行预测和分析，结果显示草菇smHsp存在7个丝氨酸(Ser)、2个苏氨酸(Thr)和2个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。

利用SOPMA对草菇smHsp的二级结构进行了预测，该蛋白二级结构中，α-螺旋(Hh)占32.19%，延伸链(Ee)占23.29%，β-转角(Tt)占13.01%，无规则卷曲(Cc)占31.51%。根据蛋白质二级结构分类规则(Skolnick and Fetrow, 2000)，草菇smHsp二级结构为alpha-beta型。对草菇smHsp蛋白质三维结构进行预测(图1A)，该蛋白的第7-145位氨基酸残基包含Hsp20分子伴侣，该结构域包含α晶状体蛋白和CS功能域。

将草菇smHsp的氨基酸序列在NCBI上BLAST，显示该蛋白质与多种真菌的smHsp具有很高的同源性，利用MEGA6.0将对比得到的氨基酸序列构建进化树(图1B)。草菇smHsp基因与木腐菌滑子菇(Pholiota nameko)和粪生菌灰盖鬼伞(Coprinopsiscinerea okayama7#130)的smHsp基因具有较高的亲缘关系，而与小皮伞科的(Moniliophthoraroreri MCA 2997)和口蘑科的鸡枞菌(Termitomyces sp. J132)的亲缘关系较远。

进化树构建选择的菌株与菌株的GenBank收录号如下：Moniliophthoraroreri (KTB40349.1)；Moniliophthoraroreri MCA 2997 (XP_007853365.1)；Pleurotus ostreatus PC15 (KDQ33327.1)；Coprinopsiscinerea okayama 7#130 (XP_001835743.1)；Laccaria bicolor S238N-H82 (XP_001880247.1)；Laccariaamethystina LaAM-08-1 (KIJ93903.1)；Schizophyllum commune H4-8 (XP_003031435.1)；Fistulina hepatica ATCC 64428 (KIY49679.1)；Galerinamarginata CBS 339.88 (KDR81842.1)；Termitomyces sp. J132 (KNZ75512.1)；Pholiotanameko (BAL02931.1)。

1.2草菇菌丝总RNA提取效果与smHsp基因扩增

提取的草菇总RNA产物经电泳检测可用于后续试验(图2)。常规PCR扩增获得100 bp左右的目的产物条带(图2)，且目的条带与原始序列完全一致。

smHsp基因序列为124 bp：GCCGCTTGACGGTTTCTGGAGAATCTAATATCTCGTCTGAGCATGAAGAGAATGGATATGCAGTACGCGAGAGGAGGTATGGGAAGTTCTCTCGTACTTTGCAGCTTCCCACAGGCGTAAAGGA

1.3定量标准曲线的构建

以系列稀释的质粒为模板进行实时定量PCR反应，反应结束后由Rotor-Gene3000实时荧光定量PCR仪自带的软件生成标准曲线(图3)和回归方程(表1)。构建的标准曲线R²>0.99，模板浓度与CT值之间具有良好的线性关系，smHsp基因的扩增效率(Eff %)为101.292，表明构建的标准曲线可以用于对未知样品进行准确定量。

1.4热激处理再进行低温胁迫后V23菌株smHsp基因表达变化

经RT-PCR得到低温处理下草菇V23、VH3菌株的Tub基因与smHsp基因的CT值，再通过公式计算目的基因相对含量。公式如下:

(试验组样品smHsp基因相对浓度/试验组Tub基因相对浓度)/(对照组样品smHsp基因相对浓度/对照组Tub基因相对浓度)

40 ℃热激0 h后的草菇菌株V23在低温胁迫2 h时，smHsp基因相对表达量明显下降，约为对照组(V23, 0 h)的0.31倍(图4)；低温胁迫4 h时，为对照组的0.12倍；低温胁迫6 h时，为对照组的0.35倍；低温胁迫8 h时，相对表达量下降，为对照组的0.11倍；低温胁迫10 h时，其相对表达量与8 h时基本保持不变。

草菇菌株V23经40 ℃热激2 h后，smHsp基因相对表达量上升，约为对照组的6.01倍；再经低温胁迫2 h时，smHsp基因相对表达量进一步上升，为对照组的9.34倍；低温胁迫4 h时，其相对表达量出现下降，为对照组的4.68倍；低温胁迫6 h时，相对表达量又出现回升趋势，为对照组的8.12倍；低温胁迫8 h时表达量继续上升，为对照组的11.07倍；低温胁迫10 h时，相对表达量基本不变，为对照组的10.75倍。

未经热激处理只进行低温胁迫的V23菌丝体中smHsp基因的相对表达量变化呈先下降再上升后又下降并趋于稳定的趋势，且低温胁迫后的菌丝均低于未进行低温胁迫的菌丝smHsp基因的相对表达量。经过40 ℃热激2 h后再进行低温胁迫的V23菌丝体中smHsp基因的相对表达量变化呈现出先上升再下降后又有所回升的趋势，除低温胁迫4 h的菌丝低于未进行低温胁迫的菌丝smHsp基因的相对表达量外，低温胁迫2、6、8、10 h的菌丝均高于未进行低温胁迫的菌丝smHsp基因的相对表达量。V23菌株在经过40 ℃热激2 h后再进行低温胁迫与之前只进行低温胁迫相比，两者的smHsp基因相对表达量变化趋势不同，但经过40 ℃热激处理2 h的V23菌丝体中目的基因相对表达量均显著高于同时期未经热激处理的相对表达量。以上结果表明热激处理增加了V23在受到低温胁迫时smHsp基因的相对表达量，热激诱导产生的smHsp可能参与了V23低温胁迫时蛋白损伤的修复，可能有助于增强V23对低温胁迫的抵御能力。

1.5热激处理再进行低温胁迫后VH3菌株smHsp基因表达变化

40 ℃热激0 h再低温胁迫2 h的草菇菌株VH3与对照组相比，smHsp基因相对表达量为起始的0.38倍(图5)；低温胁迫4 h时，为对照组的0.23倍；低温胁迫6 h时，smHsp相对表达量进一步下降至对照组的0.17倍；低温胁迫8 h时，smHsp相对表达量开始上升，约为对照组的0.26倍；低温胁迫10 h时，smHsp相对表达量再次回升，为对照组的0.41倍。

经40 ℃热激2 h的草菇菌株VH3，再经低温胁迫0~4 h时，其smHsp基因相对表达量呈上升趋势，分别约为对照组的5.97，6.76和8.45倍；低温胁迫6 h时，其相对表达量有所下降，为对照组的6.88倍；低温胁迫8~10 h时，其相对表达量又有所回升，分别为的7.18和7.51倍。

未经热激处理只进行低温胁迫的VH3菌丝体中smHsp基因的相对表达量变化呈先下降再上升的趋势，且低温胁迫后的菌丝均低于未进行低温胁迫的菌丝smHsp基因的相对表达量。经过40 ℃热激2 h后再进行低温胁迫的VH3菌丝体中smHsp基因的相对表达量变化则与上述呈相反趋势，呈现出先上升再下降后又有所回升的趋势，且低温胁迫后的菌丝均高于未进行低温胁迫的菌丝smHsp基因的相对表达量。VH3菌株在经过40 ℃热激2 h后再进行低温胁迫与只进行低温胁迫相比，两者的smHsp基因相对表达量变化趋势虽有不同，但经过40 ℃热激处理2 h的VH3菌丝体中目的基因相对表达量均显著高于同时期未经热激处理的相对表达量。综上，热激处理使VH3在受到低温胁迫下smHsp基因的相对表达量大幅提高，热激诱导产生的smHsp可能也参与了VH3低温胁迫时蛋白损伤的修复，可能有助于改善VH3对低温胁迫的耐受能力。

2讨论

smHsp是原核和真核生物热激反应中最为常见的一类热激蛋白(Siddique et al., 2008)，在植物中开展的相关研究较多，其种类多达20多种。热激逆境会导致包括smHsp在内的很多Hsp基因大量瞬时表达，这种表达受热激因子(heat shock factor, Hsf)的调控。smHsp可以由高温、低温、干旱、紫外照射等胁迫进行诱导表达(Kadyrzhanova et al., 1998)。作为热激蛋白家族成员，smHsp也具备分子伴侣的功能(Lee et al., 1995; Mamedov and Shono, 2008)，过量表达的smHsp可以提高细胞对非生物胁迫的抗逆性(Lee, 2000; Wang et al., 2005; Guo et al., 2007)。smHsp的诱导表达不仅可以提高植物的耐热性，也可有效提高植物的耐冷性(宫伟娜, 2009)。草菇属高温型食用菌，采摘后的草菇子实体呼吸作用仍然强烈，其在4 ℃以下的低温条件下会因多酚氧化酶、蛋白酶等因素变化的影响而发生低温自溶(陈明杰, 2000)。本课题组在草菇相关组学分析中发现，smHsp基因在经过热激处理的V23菌株和未经热激处理的V23菌株中表达差异显著，这种现象同样在VH3菌株中出现，因此本实验利用RT-PCR技术，验证smHsp基因与草菇对低温的抵御能力之间的相关性。本实验结果表明，经过40 ℃、2 h热激处理后再进行低温胁迫的V23菌株(低温敏感型)与只进行低温胁迫的V23菌株相比，经热激处理的菌株smHsp基因相对表达量表现出先上升后下降之后又上升的趋势，这虽然与只进行低温胁迫的变化趋势不同，但是在整个实验过程中热激处理的V23菌株的smHsp基因相对表达量要显著高于后者。经过40 ℃热激2 h后再进行低温胁迫的VH3菌株(耐低温型)，其smHsp基因相对表达量在整个实验过程中也始终显著高于只进行低温胁迫的VH3菌株。综上所述，热激处理能诱导草菇菌丝体在低温胁迫下smHsp基因的大量表达，并可能有助于提高草菇对低温胁迫的抵御能力，这与在植物中smHsp基因的相关研究结果一致，但smHsp基因在草菇中的具体作用机制仍有待于进一步深入研究。

本研究主要对草菇smHsp基因生物信息学进行了分析，进一步比较了热激处理再进行低温胁迫的草菇菌株smHsp基因表达量变化，为今后对草菇耐冷性状的遗传改良提供了方向，也为进一步探究草菇低温应答机制提供一定的理论基础。

3材料与方法

3.1试验菌株

供试草菇菌株V23和VH3由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供。

3.2草菇smHsp基因生物信息学

草菇smHsp基因编码区的获得：根据本实验室已完成的草菇表达谱数据smHsp基因同源物种该基因的编码区序列在NCBI上与草菇全基因组序列信息进行blastx比对，获得草菇Vv-smHsp基因编码区序列 。

草菇smHsp基因生物信息学分析：Vv-smHsp基因基本理化性质预测和分析利用Protparam软件；识别信号肽采用SignalP4.1 Server软件，跨膜结构预测利用TMHMM Server软件；蛋白亚细胞定位通过TargetP 1.1 Serve软件；磷酸化位点预测分析使用NetPhos 2.0软件；草菇热激蛋白二级结构预测利用SOPMA程序；三级结构使用在线SWISS-MODEL软件分析；蛋白保守结构域分析使用SMART软件。从NCBI数据库获得smHsp基因相关物种的氨基酸同源序列，使用MEGA6.0构建系统发育树。

3.3草菇菌丝的处理及样品收集

参照赵妍等(2017)的方法培养草菇菌丝及样品收集，将V23和VH3菌株的菌丝先分别进行40 ℃，0 h、2 h的热激处理后再在0 ℃中分别进行不同时间的低温胁迫。

3.4草菇菌丝总RNA的提取与反转录

参照赵妍等(2017)的方法进行。

3.5引物的设计与合成

根据草菇smHsp基因编码区序列设计定量PCR引物(表2)，选取α-微管蛋白(tubulin alpha, Tub)作为内参基因。

3.6目的基因的扩增与标准品质粒的制备

采用常规PCR扩增目的基因，质粒制备及RT-PCR的标准曲线构建参照汪虹和陈明杰的方法(2007)。

3.7热激处理再进行低温胁迫后smHsp基因的荧光定量

以热激处理后再进行不同时间低温胁迫的草菇菌丝cDNA为模板，以无菌ddH₂O为阴性对照，进行定量扩增，每个样品设4个重复(赵妍等, 2017)。实时荧光定量PCR反应条件参照赵妍等(2017)的方法。

作者贡献

余昌霞和杨焕玲是本实验的设计者和执行人，完成数据分析和论文初稿的写作；赵妍指导实验设计、数据分析、论文写作和修改；黄金丽、李正鹏、查磊和董沁参与实验设计、实验操作和数据分析；陈明杰对本实验设计进行了指导实验设计并对数据分析和论文写作提供了建设性意见。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由上海市科技兴农重点公关项目(2020-02-08-00-12-F01479)资助。

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