Identification of Seed Purity on Hybrid Japonica Rice ‘Huayou 14’ Using SSR Markers

Yao Danqing ^1*　Xia Jianming ¹　Lou Jianfeng ¹　Gu Qinqin ¹　Liu Jian ¹　Zhang Yu ¹　Zhang Qiuli ¹　Zhang Weiwei ²

1 Shanghai Agricultural Technology Extension and Service Center, Shanghai, 201103; 2 Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry, Shanghai, 201699

*Corresponding author,ydq_726@163.com

Abstract　In this study, the hybrid japonica rice ‘Huayou 14’ and its parents were used as materials, using SSR molecular marker technology, to select primers and identify seed purity according to its polymorphism. From 48 pairs of candidate SSR molecular markers widely distributed on 12 rice chromosomes, 6 pairs of primers were screened, which showed stable codominance between the hybrid and its parents. Completely distinguished, using these primers to carry out molecular purity identification of ‘Huayou 14’ seeds, and comparing the identification results with the field planting purity identification results, the results showed that the identification results of the two were basically the same. Finally, the RM274 and RM1195 marker combinations with the most polymorphic sites and the most significant differences in specificity were finally determined as core primers, and a more rapid and effective technical method for identifying the seed purity of hybrid japonica rice ‘Huayou 14’ was established.

Keywords　SSR marker; Japonica hybrid rice; ‘Huayou 14’; Purity identification

水稻(Oraza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，尤其是具备亲本优良性状的杂交稻品种，由于具有高产、优质等特点，在中国各地被广泛种植和推广，有效的保证了持续稳定、高产优质的农业生产。在实际生产中，杂交种纯度高低直接影响农作物的产量和质量，要充分发挥杂种优势潜力也必须以高纯度的杂交种为基础，所以种子纯度鉴定一直都是良种推广应用过程中最重要的指标。

田间小区种植鉴定是目前鉴定杂交水稻品种纯度应用最广泛的方法(孙海燕等, 2014)。但其鉴定周期长、工作量大、成本高、易受环境影响，不能满足种子企业生产经营的需求。为此，探索一种简单快速、准确低廉的杂交种纯度鉴定方法，对于促进企业合规经营生产种子和提高政府对种子市场的监管效率具有重要意义。近年来分子标记技术的飞速发展，使其成为鉴别种子纯度的重要方法(Yashitola et al., 2002)，特别是SSR标记，具有简单便捷，易于标准化，对DNA数量及质量要求不高，检测结果准确可靠，重复性好等特点，已广泛应用于油菜(梅德圣等, 2010)、水稻(王明湖等, 2014)、玉米(武岩军等, 2012)、黄瓜(崔兴华等, 2015)等农作物杂交种的纯度鉴定，并且被国际种子检验协会(ISAT)推荐为品种纯度及真实性检测的首选方法。

‘花优14’是上海近年来选育的粳型优质高产三系杂交水稻，较上海水稻平均产量增产10%以上，品质主要指标达到国标优质米一级标准,在长三角地区已累计推广种植7×10⁵亩，经济和社会效益显著。本研究拟用杂交粳稻‘花优14’为试验材料，基于SSR标记技术建立一套更为快速、有效的鉴定杂交粳稻‘花优14’种子纯度的技术方法，为大面积推广提供技术支撑。

1结果与分析

1.1水稻‘花优14’及其亲本的全基因组DNA提取

检测结果显示，从‘花优14’及其母本‘申9A’、父本‘繁14’中提取的水稻基因组DNA，以及待检测样品的全部DNA都只有1条带。结果表明提取的基因组DNA纯度及浓度皆满足后续PCR扩增要求(图1)。

图 1 水稻DNA提取结果图 注: SM孔为size maker; CK为阴性对照 Figure1 Electrophoretogram of rice genomic DNA Note: The first hole was size maker ; The sixth hole was negative controlnagement model in private dairy farm India as well as abroad

1.2‘花优14’特异性引物的筛选及验证

(一)建立‘花优14’DNA指纹数据筛选特异性引物

实验结果表明，大部分SSR引物可以扩增出稳定清晰的条带，其中，‘花优14’与亲本之间能将杂交种与亲本区别开的有15对SSR引物(表1)。检测结果所示(图2)，‘花优14’的带型是两个亲本互补带型，能将亲本与‘花优14’特异区分，初步表明用这15对SSR引物可以鉴定‘花优14’品种纯度。

表 1 ‘花优14’及其亲本引物筛选结果汇总表 Table 1 ‘Huayou 14’ hybrid and its parental primer screening results

图 2 ‘花优14’及其亲本DNA指纹数据及2018120小区种植鉴定杂株特异性分析图 注: 1: 父本; 2: 母本; 3: ‘花优14’; 4:2018120样品小区种植鉴定圃F1代种子样品; 5, 6: 2018120样品小区种植鉴定圃杂株样品 Figure 2 Results of primer specificity analysis of ‘Huayou 14’ hybrid and its parental Analysis of plant specificity in 2018120 plot planting identification Note: 1: Male line; 2: Femaleline; 3: ‘Huayou 14’; 4: Sample of hybrid in plot planting identification field in 2018120; 5, 6: Sample of miscellaneous plants in plot planting identification field in 2018120

(二)利用杂株类型定性鉴定筛选和验证特异性引物

通过对杂株进行SSR引物特异性分析，最终筛选出可将各杂株类型和F₁代种子区分开的15对SSR标记(图2, 图3)，结果显示，与前面借助杂交组合及其亲本DNA指纹图谱筛选出的双亲互补型的15对SSR引物一致，通过这15对标记可以有效鉴定出所有表现型的杂株。此外，在通过田间调查植株表型所选取的杂株类型1-17号样品中，存在部分杂株样品的基因型与‘花优14’F₁代种子(18号样品)的基因型一致(图3)，可见通过分子标记辅助验证，相比形态学观察而言，能够更加准确的鉴别杂株类型。

图 3 ‘花优14’样品2017108小区种植鉴定杂株特异性分析图 注: 1-17: 2017108样品小区种植鉴定圃杂株样品; 18: 2017108样品小区种植鉴定圃F1代种子样品 Figure 3 Analysis of plant specificity in 2017108 plot planting identification Note: 1-17: Sample of miscellaneous plants in plot planting identification field in 2017108; 18: Sample of hybrid in plot planting identification field in 2017108

1.3 SSR标记鉴定品种纯度的有效性验证

利用所筛选的15对SSR分子标记，进行了连续两年的SSR标记鉴定品种纯度技术方法的有效性验证，筛选确定了6个引物可用于鉴定品种纯度(图4, 图5)。第一年，对编号为2017108号样品的264粒‘花优14’单粒种子进行分子纯度鉴定。结果表明，以A05为例，具有与父母本完全互补特异条带的单株260粒，经计算，‘花优14’品种纯度为 98.5%；其它假‘花优14’中，‘花优14’特异带型种子有0粒，具有‘申9A’特异带型种子有4粒。田间鉴定统计，在1 000株杂交种当中与‘花优14’形态不一致的有17株，即‘花优14’种子的纯度为98.3%。第二年，对编号为2018120号样品的196粒‘花优14’单粒种子进行分子纯度鉴定，方法同上，分别将两个样品的田间调查鉴定与分子标记检测结果进行比较(表2)，结果基本吻合，表明筛选出的引物鉴定‘花优14’种子纯度的结果是正确可信的。整个繁种过程都有进行人工去杂，因此与亲本带型相同的假种子可能都来自母本种子的混杂。

图 4 引物A1鉴定‘花优14’2017108样品单粒群体结果图 注: 65, 79, 199: 假种子, 其余全为杂交种 Figure 4 The results of primer A1in the group of ‘Huayou 14’ Note: 65, 79, 199: The seeds were false, other of seeds were hybrids

图 5 引物A5鉴定‘花优14’2018120样品单粒群体结果图 注: 11, 18, 68, 71, 80, 110, 134, 146, 158: 假种子, 其余全为杂交种 Figure 5 The results of primer A5in the group of ‘Huayou 14’ Note: 11, 18, 68, 71, 80, 110, 134, 146, 158: The seeds were false, other of seeds were hybrids

表 2 田间纯度鉴定和分子纯度鉴定结果比较 Table 2 Comparison of field purity test and molecular purity test

2讨论

杂交水稻种子纯度的高低严重影响其品质和产量，是鉴定杂交水稻种子质量的重要指标。以往，鉴定杂交水稻品种纯度通常采用田间小区种植鉴定方法，这种方法虽然结果比较准确，但鉴定过程对操作人员的专业素质要求比较高，需要有丰富的田间生产经验，而且鉴定周期长、鉴定成本高、效率低，现在已很难满足杂交水稻种子市场化发展的要求。SSR分子鉴定技术不依赖于对品种特征特性的了解，也不受种植影响，所以鉴定结果更可靠，目前该技术已得到了广泛应用(孙海燕等, 2014)。

本研究利用48对SSR 标准引物对杂交粳稻品种‘花优14’及其亲本(恢复系‘繁14’和不育系‘申9A’)进行了基因型分析，建立了该杂交组合DNA指纹数据，筛选出15对区分‘花优14’与亲本的特异性标记。同时，连续两年在田间小区种植鉴定圃进行杂株类型的调查鉴定，通过对杂株类型的定性分析，筛选得到的15对特异性标记结果与前者一致，初步建立了杂交粳稻‘花优14’种子纯度分子鉴定技术方法。为了验证该技术方法的有效性，挑选了6对特异性较显著的引物对2017年和2018年生产的杂交粳稻‘花优14’种子进行了分子纯度鉴定，结果与大田鉴定结果基本一致。这说明利用这6对引物鉴定杂交粳稻‘花优14’种子的纯度比较准确，而且简单高效。此外，利用这6对引物为候选标记对其他长三角地区杂交粳稻种子进行纯度鉴定试验，发现其遗传多态性较高，今后也可以用于其他品种纯度鉴定试验当中。

鉴于RM274和RM1195的多态性位点最多且特异性差异最显著，考虑到分子鉴定成本，最终确定形成“基于RM274和RM1195标记组合的杂交粳稻‘花优14’种子纯度分子鉴定技术方法”。该技术方法对于杂交粳稻品种‘花优14’的合法经营以及政府的质量监控具有重要意义。

3材料和方法

3.1供试材料

‘花优14’及其亲本(恢复系‘繁14’和不育系‘申9A’)标准样品以及2017和2018年生产的‘花优14’F₁代种子(样品编号: 2017108和2018120)，均由上海市农作物种子质量检测中心提供。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

分别从编号为2017108和2018120的样品中随机选取1 000粒种子，在海南进行田间小区种植鉴定，取鉴定圃中的主要杂株类型进行特异性分析，筛选出可将杂株类型区分开的SSR标记。

3.2水稻基因组DNA提取

‘花优14’及其亲本(恢复系‘繁14’和不育系‘申9A’)，以及取自鉴定圃中的杂株材料，每样本取20粒种子，置于2 ml圆底离心管中，加入2颗钢珠，用QIAGEN研磨器，最大频率研磨20 min，制备提取DNA，采用QIGAEN植物基因组DNA试剂盒提取。DNA提取后于0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，DNA纯度和浓度测量利用NanoDrop2000c紫外可见光谱仪进行测定，稀释至40~50 ng/μL的工作液于冰箱４ ℃备用。

用于验证分子纯度鉴定方法的水稻样品2017108和2018120的单粒种子，利用种子DNA磁珠法提取水稻基因组DNA，提取试剂盒为长春市志昂生物科技有限公司生产，型号为GO-GPLF-FX96，使用仪器包括Thermo FLEX核酸提取仪，混匀小精灵，离心机，金属浴/水浴/空气浴。

3.3引物的筛选及验证

(一)建立‘花优14’DNA指纹数据筛选特异引物

以‘花优14’及其亲本的基因组DNA为模板，进行PCR扩增筛选多态性好的SSR引物。选择原农业部颁布的行业标准《水稻品种鉴定技术规程 SSR标记法》中48对SSR引物对水稻品种进行PCR扩增及基因型鉴定。PCR扩增为20 μL体系，扩增程序为：94 ℃先预变性5 min，然后94 ℃变性40 s，55~60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，共37个循环；72 ℃延伸10 min，扩增产物4 ℃保存。扩增结束后，采用毛细管电泳进行分析，通过QIAxcelScreenGel 1.4版软件对原始数据进行分析，确定每个SSR位点的基因型。杂交种带型为两个亲本互补型为目的引物。

(一)利用杂株类型定性鉴定筛选和验证特异性引物

在田间小区种植鉴定圃(2017108和2018120)分别选取了17个杂株样品和2个杂株样品连续两年，通过形态学观察选取杂株样品，利用48对SSR标记对这些杂株进行特异性分析，进一步验证筛选引物的有效性。总反应体系和反应程序同上。

3.4 SSR标记鉴定品种纯度技术方法的验证

分别从样品2017108和2018120中随机选取了264粒和196粒单粒种子，用所选取的群体单粒‘花优14’种子验证筛选的SSR 引物，SSR引物筛选试验与上述实验相同，观察筛选引物对群体单粒种子检测结果并进行对比拟合。

3.5水稻种子不同纯度鉴定方法的比较

在SSR分子鉴定中，用目的引物对随机选取的群体单粒‘花优14’种子进行SSR鉴定，SSR引物试验体系和程序与上述过程相同。在常规田间小区种植鉴定中，在海南陵水试验基地种植1 000株‘花优14’，观察其表型性状一致性。纯度(%)=杂交种子株数/总株数×100。比较SSR分子鉴定方法和田间小区种植鉴定方法的结果相似性。

作者贡献

姚丹青是项目的负责人、本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；楼坚锋、顾芹芹、张玉、张秋丽提供了本研究的实验材料准备工作，张微微、刘建参与实验设计和试验结果分析；夏建明指导实验设计、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由上海市农口系统青年人才成才计划项目基金(沪农青字(2018)第9-1号)、优质稻米全产业链绿色生产模式开发项目专题二(沪农科推字(2018)第1-1号)和优质稻绿色生产技术的研究和示范(沪农科产字(2018)第3号专项)资助。

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