由黄单孢菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) 引起的白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害之一。稻作生产中防治该病害最经济有效的方法是选育推广抗病的新品种，包括抗性更强的多基因聚合的品种 (Huang et al., 1997)，这就要求水稻研究人员充分发掘、鉴定和评价有育种利用价值的稻种资源(王春莲等, 2004; 夏志辉等, 2009; 郑崇珂等, 2009)。迄今为止，已经在全球稻种资源中鉴定了32个白叶枯病抗性基因(郑崇珂等, 2009; 章琦, 2005; 金旭炜等, 2007)，其中19个基因通过经典遗传和分子标记方法进行了定位，有7个基因通过图位法得到克隆分离，包括Xa1、Xa21、Xa23、Xa26(Xa3)和Xa27等5个显性基因以及xa5和xa13两个隐性基因(Yoshimura et al., 1998; Xiang et al., 2006; Song et al., 2005; 张小红等, 2008; Sun et al., 2004; Gu et al., 2005; Iyer et al., 2004; Chu et al., 2006)。通过基因克隆，不仅为抗病基因的作用机制的探明奠定基础，同时也发掘了相应的分子标记，为利用标记辅助选择等现代生物学技术培育白叶枯病抗性水稻新品种提供了有利的技术支撑(章琦, 2009)。

近年来，我国十分重视高产、优质与抗病的超级稻的选育和推广。R9308是超级稻协优9308的恢复系，用其配组的协优9308是中国水稻研究所培育的首个超级杂交水稻，米质优、对白叶枯病表现中抗，曾经被农业部列为重点推广的超级稻之一。亲本之一的协青早A/B对白叶枯病抗性不佳(姬广海等, 2000)，因此协优9308的抗病性主要来源于恢复系R9308，但R9308的白叶枯病抗性基因一直未有深入研究。实际上，缺少对绝大多数新品种及其亲本的抗性组份的研究现象在我国非常普遍，这也限制了这些新品种与亲本在育种中的进一步有目的利用，造成盲目配组选育现象。另外，在新品种的各级区试中一般采用混合菌株进行抗性评价，也无法知道新品种中的抗性基因。本文试图利用DNA分子标记结合田间抗性评价对协优9308、协青早B、恢复系R9308及其亲本可能含有的白叶枯病抗性基因进行鉴定，探讨R9308的抗性基础，为恢复系R9308进一步育种利用与改良提供依据。

1结果与分析
1.1分子标记验证
利用检测5个白叶枯病抗性基因的5对分子标记对上述材料进行分析。结果表明，所有5对引物均能扩增出PCR产物。其中，检测Xa4基因的引物Xa4在Xa4单基因系IRBB4、R9308、IR26、协A/R9308以及协B/R9308中检测到一条约150 bp的帯，此外，该引物还在IRBB10中检测到相同的帯，这是因为IRBB10中的Xa10与Xa4之间的重组值为10% (图1)。相反，在协B、300号、C57以及感病对照IR24中没有检测到该带，而检测到一条约120 bp的帯。由于300号、C57和IR26均为R9308的亲本，因此上述结果说明，恢复系R9308中可能存在白叶枯病抗性基因Xa4，而且该基因来源于其亲本之一的IR26，另外两个亲本300号和C57不含Xa4基因。检测xa5基因的引物xa5在xa5单基因系IRBB5以及R9308、协B、300号、协A/R9308和协B/R9308中检测到一条约287 bp的帯，而在IR26和对照IR24中检测到一条略小的帯，C57扩增不出任何带。这一结果说明R9308、协B和300号中可能存在xa5基因。对于另外3个基因Xa7、xa13和Xa21，仅分别在其单基因系IRBB7、IRBB13、IRBB21中检测到相应的帯，而在R9308、协B、300号、C57、IR26、协A/R9308和协B/R9308中没有检测到相应的帯。这一结果说明，R9308中不存在上述三个基因。此外，我们还对Xa23、Xa27和Xa32(t)也分别进行了检测，但也未发现有任何相关性(未发表数据)。

图1 白叶枯病抗性基因Xa4的标记分析 Figure 1 Marker detection on bacterial blight resistance gene Xa4

1.2白叶枯病抗性表现
为了验证R9308中是否存在Xa4和xa5两个抗性基因，我们利用一套菲律宾白叶枯病抗性小种对其抗性进行了鉴定。结果表明，协B、300号和感病对照IR24对所有小种均表现感病(表1)。与单基因系IRBB5相比，R9308也在5个小种上(PXO71, 112, 340, 145, 280)有抗性差异，这一结果说明，在R9308、协B和300号中检测到的与IRBB5相同的帯可能仅仅是xa5的等位基因，不具有抗性功能，或者说R9308中不存在xa5基因。虽然与单基因系IRBB4的抗谱不尽相同，但R9308和IR26的抗谱最为接近，此外两个杂种协A/R9308和协B/R9308与R9308一致，而且也与IRBB4相似。结合分子标记检测结果，说明恢复系R9308的主要白叶枯病抗源基因为Xa4。另外，R9308与IRBB4最主要的抗性差异表现在小种9上，R9308为抗，而IRBB4为感病，说明R9308可能存在未知的抗病基因。

表1 白叶枯病抗性鉴定结果 Table 1 Evaluation of bacterial blight resistance

2讨论
我国具有丰富的稻种资源，发掘稻种资源中的抗性基因甚至远源抗性基因是改良水稻抗性的重要途径(章琦, 2005; 沈玮玮等, 2010)。与其他病害一样，培育抗白叶枯病的水稻新品种是防治该病害的最有效途径。迄今为止，科学家已经在全球稻种资源中鉴定了32个白叶枯病抗性基因。其中Xa7、xa5、Xa21和Xa23等基因具有广谱抗性，是白叶枯病抗性改良的首选基因，可以通过标记辅助选择进行聚合的方法加以利用。这一方法在白叶枯病抗性改良种已经证明是行之有效的方法(Huang et al., 1997; Cao et al., 2003)。

在杂交水稻选育中，通常利用的是显性白叶枯病抗性基因，除非不育系和恢复系中都含有相同的隐性基因。虽然已经鉴定了30余个白叶抗病基因，但在生产实践中应用的往往是少数几个基因。在我国，利用频率最高的是Xa4基因，抗源狭窄，潜藏白叶枯病大爆发的危险。因此，有目的的利用多基因抗性是解决这一问题的有效途径。为此，需要在品种选育过程中对亲本材料的抗性基础具有充分的了解。中国水稻研究所培育的杂交水稻恢复系R9308具有许多优异的农艺性状，分别来源于C57、300号和IR26。对国内白叶枯病小种的混合接种表现中抗，但抗性基因以及其来源不清楚。本文采用单小种鉴定方法，对杂交稻协优9308及其亲本协B和恢复系R9308，R9308的三个亲本300 号、C57和IR26分别进行了鉴定。与预期的一致，R9308的抗性基因来源于IR26的Xa4，但R9308的抗谱较Xa4为广，因此可能还存在其他抗性基因，需要进一步研究。从本研究结果看，R9308中不含Xa7、xa13和Xa21，也未检测到与Xa23、Xa27和Xa32(t)的相关，但包括这些基因在内，许多白叶枯病抗性基因还缺少相应的单基因系。因此，需要加强这方面的研究，为新基因的快速鉴定、等位性的研究等提供了基础。

3材料与方法
3.1水稻材料
R9308为本课题组选育的籼型杂交稻恢复系，亲本为C57、300号和IR26。2009年R9308与协青早B共同种植于中国水稻研究所海南繁育基地。以协青早A和B为母本，R9308为父本分别配置组合。2010年两个F₁、协青早B、R9308及其3个亲本以及白叶枯病抗性单基因系IRBB3、IRBB4、IRBB5、IRBB7，IRBB8、IRBB10、IRBB11、IRBB13、IRBB14和IRBB21作为单季稻种植于中国水稻所富阳实验基地网室内。

3.2白叶枯病小种与接种
采用10个菲律宾白叶枯病小种进行抗性鉴定，分别为小种1 (PXO61)、小种2 (PXO86)、小种3 (PXO79)、小种4 (PXO71)、小种5 (PXO112)、小种6 (PXO99)、小种7 (PXO145)、小种8 (PXO280)、小种9 (PXO339)和小种10 (PXO341)。所有菌系于甘油中保存在−80℃冰箱，接种前用Wakimoto培养基复壮菌株，置于28℃培养48 h，以无菌水配制接种菌液，浓度调至1×10⁹ CFU m/L，在成株期采用剪叶法接种，每个材料接种三片叶。接种后15天量取病斑长度和叶片总长，以病斑长度占20%为抗感标准，小于10%为抗病(R)，10~20%为中抗(MR)，20~30%为中感(MS)，大于30%为感病(S)。

3.3引物设计与PCR扩增
采用简易法提取水稻DNA (卢扬江和郑康乐, 1992)。利用文献报道合成了检测5个白叶枯病抗性基因的PCR引物(表2)。50 µL PCR扩增体系中含：5 µL 10×PCR缓冲液(Invitrogen)，10 µmol/L dNTP (鼎国)，2 µL 50 mmol/L MgSO₄，1 µL 10 µmol/L前引物，1 µL 10 µmol/L后引物，1单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen)，2 µL模板DNA。反应条件：94℃预变性2分钟；94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 60秒，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

表2 用于抗性基因检测的分子标记 Table 2 Molecular markers used for assay of bacterial blight resistance genes

作者贡献
陈深广和杨杨是本研究的实验设计和实验研究的执行人，也是数据分析，论文初稿的完成人；吴建利和程式华是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家863计划专项(2009AA101101)和农业部超级稻专项(2006-9)资助。感谢国际水稻研究所VeraCruz博士提供白叶枯病菌小种。

参考文献
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